Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride
Summary
Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho0 ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.
Abstract
La carence en complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale qui effectuent la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est le marqueur biochimique des troubles mitochondriaux humains. D’un point de vue génétique, l’OXPHOS représente un exemple unique car il résulte de la complémentarité de deux systèmes génétiques distincts : l’ADN nucléaire (ADNn) et l’ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les défauts OXPHOS peuvent être dus à des mutations affectant les gènes codés nucléaires et mitochondriaux.
Les travaux révolutionnaires de King et Attardi, publiés en 1989, ont montré que les lignées cellulaires humaines appauvries en ADNmt (nommées rho0) pouvaient être repeuplées par des mitochondries exogènes pour obtenir les soi-disant « cybrides transmitochondrials ». Grâce à ces cybrides contenant des mitochondries dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux (MD) et des noyaux de cellules rho0 , il est possible de vérifier si un défaut est lié à l’ADNmt ou à l’ADNn. Ces cybrides sont également un outil puissant pour valider la pathogénicité d’une mutation et étudier son impact au niveau biochimique. Cet article présente un protocole détaillé décrivant la génération, la sélection et la caractérisation des cybrides.
Introduction
Les troubles mitochondriaux (MD) sont un groupe de syndromes multisystémiques causés par une altération des fonctions mitochondriales due à des mutations de l’ADN nucléaire (ADNn) ou mitochondrial (ADNmt)1. Elles font partie des maladies métaboliques héréditaires les plus courantes, avec une prévalence de 1:5 000. Les maladies associées à l’ADNmt suivent les règles de la génétique mitochondriale : héritage maternel, hétéroplasmie et effet de seuil, et ségrégation mitotique2. L’ADNmt humain est un cercle d’ADN double brin de 16,6 kb, qui contient une courte région de contrôle avec des séquences nécessaires à la réplication et à la transcription, 13 gènes codant pour les protéines (toutes les sous-unités de la chaîne respiratoire), 22 ARNt et 2 gènes d’ARNr3.
Chez les individus en bonne santé, il existe un seul génotype d’ADNmt (homoplasmie), tandis que plus d’un génotype coexiste (hétéroplasmie) dans des conditions pathologiques. Les mutations hétéroplasmiques délétères doivent franchir un seuil critique pour perturber OXPHOS et provoquer des maladies pouvant affecter n’importe quel organe à tout âgede 4 ans. La double génétique d’OXPHOS dicte l’hérédité : autosomique récessive ou dominante et liée à l’X pour les mutations de l’ADNn, maternelle pour les mutations de l’ADNmt, plus des cas sporadiques à la fois pour l’ADNmt et l’ADNmt.
Au début de l’ère de la médecine mitochondriale, une expérience historique de King et Attardi5 a établi la base pour comprendre l’origine d’une mutation responsable d’un MD en créant des cellules hybrides contenant des noyaux de lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l’ADNmt était entièrement épuisé (cellules rho0) et les mitochondries de patients atteints de DM. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) n’étaient pas disponibles à cette époque, et il n’était pas facile de déterminer si une mutation était présente dans le génome nucléaire ou mitochondrial. La méthode, décrite en 1989, a ensuite été utilisée par plusieurs chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine mitochondriale 6,7,8,9; un protocole détaillé a été récemment publié10, mais aucune vidéo n’a encore été réalisée. Pourquoi un tel protocole devrait-il être pertinent de nos jours alors que NGS pourrait identifier précisément et rapidement où se trouve une mutation? La réponse est que la génération de cybrides est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADNmt, corréler le pourcentage d’hétéroplasmie avec la gravité de la maladie et effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène dans lequel la contribution du fond nucléaire autochtone du patient est absente11, 12,13.
Ce protocole décrit comment obtenir des cytoplastes à partir de fibroblastes confluents dérivés de patients cultivés dans des boîtes de Petri de 35 mm. La centrifugation des plats en présence de cytochalasine B permet l’isolement des cytoplastes énucléés, qui sont ensuite fusionnés avec des cellules rho0 en présence de polyéthylène glycol (PEG). Les cybrides résultantes sont ensuite cultivées en milieu sélectif jusqu’à l’apparition de clones. La section des résultats représentatifs montre un exemple de caractérisation moléculaire des cybrides résultantes pour prouver que l’ADNmt est identique à celui des fibroblastes des patients donneurs et que l’ADNn est identique à l’ADN nucléaire de la lignée cellulaire tumorale rho0 .
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ADNmt a un taux de mutation très élevé par rapport à l’ADNn en raison de l’absence d’histones protectrices et de son emplacement à proximité de la chaîne respiratoire, ce qui expose la molécule à des effets oxydatifs dommageables qui ne sont pas efficacement contrecarrés par les systèmes de réparation16. Les premières mutations pathogènes de l’ADNmt ont été identifiées en 198817,18, et depuis lors, un grand nom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été réalisée au Centre d’étude des maladies pédiatriques mitochondriales (http://www.mitopedia.org), financé par la Fondation Mariani. VT est membre du Réseau européen de référence pour les maladies neuromusculaires rares (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
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