Summary

Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride

Published: March 09, 2022
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Summary

Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho0 ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.

Abstract

La carence en complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale qui effectuent la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est le marqueur biochimique des troubles mitochondriaux humains. D’un point de vue génétique, l’OXPHOS représente un exemple unique car il résulte de la complémentarité de deux systèmes génétiques distincts : l’ADN nucléaire (ADNn) et l’ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les défauts OXPHOS peuvent être dus à des mutations affectant les gènes codés nucléaires et mitochondriaux.

Les travaux révolutionnaires de King et Attardi, publiés en 1989, ont montré que les lignées cellulaires humaines appauvries en ADNmt (nommées rho0) pouvaient être repeuplées par des mitochondries exogènes pour obtenir les soi-disant « cybrides transmitochondrials ». Grâce à ces cybrides contenant des mitochondries dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux (MD) et des noyaux de cellules rho0 , il est possible de vérifier si un défaut est lié à l’ADNmt ou à l’ADNn. Ces cybrides sont également un outil puissant pour valider la pathogénicité d’une mutation et étudier son impact au niveau biochimique. Cet article présente un protocole détaillé décrivant la génération, la sélection et la caractérisation des cybrides.

Introduction

Les troubles mitochondriaux (MD) sont un groupe de syndromes multisystémiques causés par une altération des fonctions mitochondriales due à des mutations de l’ADN nucléaire (ADNn) ou mitochondrial (ADNmt)1. Elles font partie des maladies métaboliques héréditaires les plus courantes, avec une prévalence de 1:5 000. Les maladies associées à l’ADNmt suivent les règles de la génétique mitochondriale : héritage maternel, hétéroplasmie et effet de seuil, et ségrégation mitotique2. L’ADNmt humain est un cercle d’ADN double brin de 16,6 kb, qui contient une courte région de contrôle avec des séquences nécessaires à la réplication et à la transcription, 13 gènes codant pour les protéines (toutes les sous-unités de la chaîne respiratoire), 22 ARNt et 2 gènes d’ARNr3.

Chez les individus en bonne santé, il existe un seul génotype d’ADNmt (homoplasmie), tandis que plus d’un génotype coexiste (hétéroplasmie) dans des conditions pathologiques. Les mutations hétéroplasmiques délétères doivent franchir un seuil critique pour perturber OXPHOS et provoquer des maladies pouvant affecter n’importe quel organe à tout âgede 4 ans. La double génétique d’OXPHOS dicte l’hérédité : autosomique récessive ou dominante et liée à l’X pour les mutations de l’ADNn, maternelle pour les mutations de l’ADNmt, plus des cas sporadiques à la fois pour l’ADNmt et l’ADNmt.

Au début de l’ère de la médecine mitochondriale, une expérience historique de King et Attardi5 a établi la base pour comprendre l’origine d’une mutation responsable d’un MD en créant des cellules hybrides contenant des noyaux de lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l’ADNmt était entièrement épuisé (cellules rho0) et les mitochondries de patients atteints de DM. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) n’étaient pas disponibles à cette époque, et il n’était pas facile de déterminer si une mutation était présente dans le génome nucléaire ou mitochondrial. La méthode, décrite en 1989, a ensuite été utilisée par plusieurs chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine mitochondriale 6,7,8,9; un protocole détaillé a été récemment publié10, mais aucune vidéo n’a encore été réalisée. Pourquoi un tel protocole devrait-il être pertinent de nos jours alors que NGS pourrait identifier précisément et rapidement où se trouve une mutation? La réponse est que la génération de cybrides est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADNmt, corréler le pourcentage d’hétéroplasmie avec la gravité de la maladie et effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène dans lequel la contribution du fond nucléaire autochtone du patient est absente11, 12,13.

Ce protocole décrit comment obtenir des cytoplastes à partir de fibroblastes confluents dérivés de patients cultivés dans des boîtes de Petri de 35 mm. La centrifugation des plats en présence de cytochalasine B permet l’isolement des cytoplastes énucléés, qui sont ensuite fusionnés avec des cellules rho0 en présence de polyéthylène glycol (PEG). Les cybrides résultantes sont ensuite cultivées en milieu sélectif jusqu’à l’apparition de clones. La section des résultats représentatifs montre un exemple de caractérisation moléculaire des cybrides résultantes pour prouver que l’ADNmt est identique à celui des fibroblastes des patients donneurs et que l’ADNn est identique à l’ADN nucléaire de la lignée cellulaire tumorale rho0 .

Protocol

REMARQUE: L’utilisation de fibroblastes humains peut nécessiter une approbation éthique. Les fibroblastes utilisés dans cette étude ont été dérivés de patients atteints de DM et stockés dans la biobanque institutionnelle conformément aux exigences éthiques. Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules. Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire sous une armoire à flux laminaire stérile à température ambiante (RT, 22-25 °C). Utilisez des solutions filtrées stér…

Representative Results

La génération de cybrides nécessite 3 jours de travail en laboratoire plus une période de sélection (~ 2 semaines) et 1-2 semaines supplémentaires pour la croissance des clones. Les étapes critiques sont la qualité des cytoplastes et la période de sélection. La morphologie des cybrides ressemble à celle des cellules donneuses rho0. L’attribution de l’ADNmt et de l’ADNn corrects dans les cybrides est obligatoire pour confirmer l’identité des cellules. Un exemple est donné à <strong class="…

Discussion

L’ADNmt a un taux de mutation très élevé par rapport à l’ADNn en raison de l’absence d’histones protectrices et de son emplacement à proximité de la chaîne respiratoire, ce qui expose la molécule à des effets oxydatifs dommageables qui ne sont pas efficacement contrecarrés par les systèmes de réparation16. Les premières mutations pathogènes de l’ADNmt ont été identifiées en 198817,18, et depuis lors, un grand nom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été réalisée au Centre d’étude des maladies pédiatriques mitochondriales (http://www.mitopedia.org), financé par la Fondation Mariani. VT est membre du Réseau européen de référence pour les maladies neuromusculaires rares (ERN EURO-NMD).

Materials

5-Bromo-2'-Deoxyuridine Sigma-Aldrich (Merck) B5002-500MG
6 well Plates Corning 3516
96 well Plates Corning 3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit QIAGEN 13323
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL Beckman Coulter 356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea Sigma-Aldrich (Merck) C2743-200UL
Dialyzed FBS Gibco 26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) EuroClone ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) EuroClone ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous Carlo Erba 414601
FetalClone III (Bovine Serum Product) Cytiva – HyClone Laboratories SH30109.03
Glass pasteur pipettes VWR M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy Nikon ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor Beckman Coulter 339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770 Labotech 29960014
L-Glutamine 200 mM (100x) EuroClone ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM Euroclone ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution) Sigma-Aldrich (Merck) P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x) EuroClone ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm EuroClone ET2100
Primo TC Dishes 35 mm EuroClone ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM EuroClone ECM0542D
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS EuroClone ECB3051D
Uridine Sigma-Aldrich (Merck) U3003-5G

References

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Cite This Article
Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model. J. Vis. Exp. (181), e63452, doi:10.3791/63452 (2022).

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