Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel
Summary
Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.
Abstract
Deficiëntie van de mitochondriale respiratoire ketencomplexen die oxidatieve fosforylering (OXPHOS) uitvoeren, is de biochemische marker van menselijke mitochondriale aandoeningen. Vanuit genetisch oogpunt is het OXPHOS een uniek voorbeeld omdat het het resultaat is van de aanvulling van twee verschillende genetische systemen: nucleair DNA (nDNA) en mitochondriaal DNA (mtDNA). Daarom kunnen OXPHOS-defecten te wijten zijn aan mutaties die nucleaire en mitochondriale gecodeerde genen beïnvloeden.
Het baanbrekende werk van King en Attardi, gepubliceerd in 1989, toonde aan dat menselijke cellijnen uitgeput van mtDNA (genaamd rho0) opnieuw kunnen worden bevolkt door exogene mitochondriën om de zogenaamde “transmitochondrial cybrids” te verkrijgen. Dankzij deze cybriden die mitochondriën bevatten die afkomstig zijn van patiënten met mitochondriale aandoeningen (MD’s) en kernen van rho0-cellen , is het mogelijk om te verifiëren of een defect mtDNA- of nDNA-gerelateerd is. Deze cybriden zijn ook een krachtig hulpmiddel om de pathogeniciteit van een mutatie te valideren en de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol dat cybridegeneratie, selectie en karakterisering beschrijft.
Introduction
Mitochondriale aandoeningen (MD’s) zijn een groep multisysteemsyndromen veroorzaakt door een aantasting van mitochondriale functies als gevolg van mutaties in nucleair (nDNA) of mitochondriaal (mtDNA) DNA1. Ze behoren tot de meest voorkomende erfelijke stofwisselingsziekten, met een prevalentie van 1:5.000. mtDNA-geassocieerde ziekten volgen de regels van mitochondriale genetica: maternale overerving, heteroplasmie en drempeleffect, en mitotische segregatie2. Menselijk mtDNA is een dubbelstrengs DNA-cirkel van 16,6 kb, die een kort controlegebied bevat met sequenties die nodig zijn voor replicatie en transcriptie, 13 eiwitcoderende genen (alle subeenheden van de ademhalingsketen), 22 tRNA en 2 rRNA-genen3.
Bij gezonde personen is er één enkel mtDNA-genotype (homoplasmie), terwijl meer dan één genotype naast elkaar bestaat (heteroplasmie) in pathologische omstandigheden. Schadelijke heteroplasmatische mutaties moeten een kritische drempel overwinnen om OXPHOS te verstoren en ziekten te veroorzaken die elk orgaan op elke leeftijdvan 4 jaar kunnen beïnvloeden. De dubbele genetica van OXPHOS dicteert overerving: autosomaal recessief of dominant en X-gebonden voor nDNA-mutaties, maternale voor mtDNA-mutaties, plus sporadische gevallen zowel voor nDNA als mtDNA.
Aan het begin van het mitochondriale geneeskundetijdperk legde een baanbrekend experiment van King en Attardi5 de basis om de oorsprong van een mutatie die verantwoordelijk is voor een MD te begrijpen door hybride cellen te maken die kernen bevatten uit tumorcellijnen waarin mtDNA volledig was uitgeput (rho0-cellen) en mitochondriën van patiënten met MD’s. Next-generation sequencing (NGS) -technieken waren op dat moment niet beschikbaar, en het was niet eenvoudig om te bepalen of een mutatie aanwezig was in het nucleaire of mitochondriale genoom. De methode, beschreven in 1989, werd vervolgens gebruikt door verschillende onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van mitochondriale geneeskunde 6,7,8,9; een gedetailleerd protocol is onlangs gepubliceerd10, maar er is nog geen video gemaakt. Waarom zou zo’n protocol tegenwoordig relevant zijn als NGS precies en snel kan identificeren waar een mutatie zich bevindt? Het antwoord is dat cybridegeneratie nog steeds het state-of-the-art protocol is om de pathogene rol van elke nieuwe mtDNA-mutatie te begrijpen, het percentage heteroplasmie te correleren met de ernst van de ziekte en een biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem waarin de bijdrage van de autochtone nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is11, 12,13.
Dit protocol beschrijft hoe cytoplasten kunnen worden verkregen uit confluente, patiënt-afgeleide fibroblasten gekweekt in 35 mm petrischalen. Centrifugering van de schotels in aanwezigheid van cytochalasine B maakt de isolatie van enucleated cytoplasten mogelijk, die vervolgens worden gefuseerd met rho0-cellen in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG). De resulterende cybriden worden vervolgens gekweekt in selectief medium totdat er klonen ontstaan. De sectie met representatieve resultaten toont een voorbeeld van moleculaire karakterisering van de resulterende cybriden om te bewijzen dat het mtDNA identiek is aan dat van de fibroblasten van de donorpatiënten en dat het nDNA identiek is aan het nucleaire DNA van de tumorale rho 0-cellijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het mtDNA heeft een zeer hoge mutatiesnelheid in vergelijking met nDNA vanwege het ontbreken van beschermende histonen en de locatie dicht bij de ademhalingsketen, waardoor het molecuul wordt blootgesteld aan schadelijke oxidatieve effecten die niet efficiënt worden tegengegaan door de reparatiesystemen16. De eerste pathogene mtDNA-mutaties werden geïdentificeerd in 1988 17,18, en sindsdien is een groot aantal mutaties beschreven. NGS-te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd uitgevoerd in het Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), gefinancierd door de Mariani Foundation. VT is lid van het European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
