גישה חוץ גופית לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה: מודל Cybrid
Summary
ציברידים טרנסברוכונדריאליים הם תאים היברידיים המתקבלים על ידי התמזגות של תאים מיטוכונדריאליים מיטוכונדריאליים (mtDNA) מדולדלים (תאי rho0 ) עם ציטופלסטים (תאים מלוכדים) שמקורם בחולים הסובלים מהפרעות מיטוכונדריאליות. הם מאפשרים לקבוע את המקור הגרעיני או המיטוכונדריאלי של המחלה, הערכה של פעילות ביוכימית, ואישור של התפקיד הפתוגנטי של גרסאות הקשורות ל- mtDNA.
Abstract
מחסור בקומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית המבצעים זרחון חמצוני (OXPHOS) הוא הסמן הביוכימי של הפרעות מיטוכונדריאליות אנושיות. מנקודת מבט גנטית, ה-OXPHOS מהווה דוגמה ייחודית משום שהוא נובע מהשלמה של שתי מערכות גנטיות נפרדות: דנ”א גרעיני (nDNA) ודנ”א מיטוכונדריאלי (mtDNA). לכן, פגמים ב-OXPHOS יכולים לנבוע ממוטציות המשפיעות על גנים מקודדים גרעיניים ומיטוכונדריאליים.
עבודתם פורצת הדרך של קינג ואטארדי, שפורסמה ב-1989, הראתה כי קווי תאים אנושיים שהתרוקנו מ-mtDNA (הנקראים rho0) יכולים להיות מאוכלסים מחדש על ידי מיטוכונדריה אקסוגנית כדי להשיג את מה שמכונה “ציברידים טרנסטרוכונדריאליים”. הודות לציברידים אלה המכילים מיטוכונדריה שמקורם בחולים עם הפרעות מיטוכונדריאליות (MDs) וגרעינים מתאי rho0 , ניתן לוודא אם פגם קשור ל-mtDNA או ל-nDNA. cybrids אלה הם גם כלי רב עוצמה כדי לאמת את הפתוגניות של מוטציה ולחקור את השפעתה ברמה ביוכימית. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט המתאר יצירת cybrid, בחירה ואפיון.
Introduction
הפרעות מיטוכונדריאליות (MDs) הן קבוצה של תסמונות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי פגיעה בתפקודים המיטוכונדריאליים עקב מוטציות בדנ”א גרעיני (nDNA) או במיטוכונדריאלי (mtDNA)1. הם בין המחלות המטבוליות התורשתיות הנפוצות ביותר, עם שכיחות של 1:5,000. מחלות הקשורות ל- mtDNA עוקבות אחר הכללים של גנטיקה מיטוכונדריאלית: תורשה אימהית, הטרופלזמה ואפקט סף, והפרדה מיטוטית2. mtDNA אנושי הוא מעגל דנ”א דו-גדילי של 16.6 קילובייט, המכיל אזור בקרה קצר עם רצפים הדרושים לשכפול ושעתוק, 13 גנים המקודדים חלבונים (כולם תת-יחידות של שרשרת הנשימה), 22 tRNA ו-2 גנים rRNA3.
אצל אנשים בריאים, יש גנוטיפ mtDNA אחד ויחיד (homoplasmy), בעוד שיותר מגנוטיפ אחד מתקיים בדו-קיום (הטרופלזמה) בתנאים פתולוגיים. מוטציות הטרופלסמיות מזיקות חייבות להתגבר על סף קריטי כדי לשבש OXPHOS ולגרום למחלות שיכולות להשפיע על כל איבר בכל איבר בכל גיל4. הגנטיקה הכפולה של OXPHOS מכתיבה תורשה: אוטוזומלית רצסיבית או דומיננטית ומקושרת X למוטציות nDNA, אימהית למוטציות mtDNA, בתוספת מקרים ספורדיים הן עבור nDNA והן עבור mtDNA.
בתחילת עידן הרפואה המיטוכונדרית, ניסוי פורץ דרך של קינג ואטארדי5 ביסס את הבסיס להבנת מקורה של מוטציה האחראית על MD על ידי יצירת תאים היברידיים המכילים גרעינים מקווי תאים סרטניים שבהם mtDNA התרוקן לחלוטין (תאי rho0) ומיטוכונדריה מחולים עם MDs. טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS) לא היו זמינות באותה תקופה, ולא היה קל לקבוע אם מוטציה קיימת בגנום הגרעיני או המיטוכונדריאלי. השיטה, שתוארה בשנת 1989, שימשה אז כמה חוקרים שעבדו בתחום הרפואה המיטוכונדרית 6,7,8,9; פרוטוקול מפורט פורסם לאחרונה10, אך עדיין לא נעשה סרטון. מדוע פרוטוקול כזה צריך להיות רלוונטי בימינו כאשר NGS יכול לזהות במדויק ובמהירות היכן נמצאת מוטציה? התשובה היא שדור cybrid הוא עדיין הפרוטוקול החדיש ביותר כדי להבין את התפקיד הפתוגני של כל מוטציה mtDNA חדשה, לתאם את אחוז ההטרופלזמה עם חומרת המחלה, ולבצע חקירה ביוכימית במערכת גרעינית הומוגנית שבה התרומה של הרקע הגרעיני האוטוכטוני של המטופל נעדרת11, 12,13.
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג ציטופלסטים מפיברובלסטים קונפלואנטיים שמקורם בחולים הגדלים בצלחות פטרי 35 מ”מ. צנטריפוגה של הכלים בנוכחות ציטוכלאסין B מאפשרת בידוד של ציטופלסטים משועבדים, אשר לאחר מכן מתמזגים עם תאי rho0 בנוכחות פוליאתילן גליקול (PEG). לאחר מכן מטפחים את הציברידים המתקבלים בתווך סלקטיבי עד שנוצרים שיבוטים. סעיף התוצאות הייצוגיות מציג דוגמה לאפיון מולקולרי של הציברידים המתקבלים כדי להוכיח כי ה-mtDNA זהה לזה של הפיברובלסטים של המטופלים התורמים וכי ה-nDNA זהה לדנ”א הגרעיני של קו תאי ה-rho0 הגידולי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ל-mtDNA יש שיעור מוטציות גבוה מאוד בהשוואה ל-nDNA בגלל היעדר היסטונים מגנים ומיקומה קרוב לשרשרת הנשימה, מה שחושף את המולקולה להשפעות חמצון מזיקות שאינן מנוגדות ביעילות על ידי מערכות התיקון16. המוטציות הפתוגניות הראשונות של mtDNA זוהו בשנת 198817,18, ומאז ת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה בוצע במרכז לחקר מחלות ילדים מיטוכונדריאליות (http://www.mitopedia.org), במימון קרן מריאני. VT הוא חבר ברשת הייחוס האירופית למחלות נוירומוסקולריות נדירות (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
