Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

El problema de medir las ondas rápidas de calcio en las células excitables es uno de los aspectos más importantes y desafiantes del estudio de la transmisión de señales en los sistemas nerviosos central y periférico. Los iones de calcio juegan un papel importante en el desencadenamiento de la liberación de neurotransmisores, la plasticidad sináptica y la modulación de la actividad de varias proteínas intracelulares 1,2,3,4,5. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar formas de tratar las enfermedades neurodegenerativas⁶. Para medir los cambios en los niveles de calcio, se utilizan comúnmente colorantes fluorescentes sensibles al calcio, y se analizan los cambios en su nivel de fluorescencia ^7,8,9.

La carga de colorantes de calcio en las células se puede lograr de diferentes maneras. Predominantemente, se utilizan colorantes perfeccionados por células^10,11. Sin embargo, en tal caso, no solo es difícil controlar la concentración de un tinte dentro de la célula, sino que también es difícil seleccionar las células objetivo para la carga. Este método no es aplicable para estudiar las terminaciones nerviosas periféricas ya que el tinte entra en las células postsinápticas. En cambio, los tintes impermean celulares son más adecuados para tales preparaciones. En este caso, los colorantes se administran a las células mediante microinyección o a través de una pipeta de parche^12,13,14. También hay un método de carga a través de un muñón nervioso. Este último método es el más adecuado para preparaciones de unión neuromuscular 15,16,17,18,19,20. Permite realizar tinción solo para células de interés. Aunque este método no proporciona una evaluación precisa de la concentración del colorante en la célula diana, la concentración puede estimarse aproximadamente comparando el nivel de fluorescencia de las células en reposo en soluciones con una concentración conocida de calcio²¹. En este estudio, se presenta una modificación de este método aplicado a las sinapsis de mamíferos.

La entrada de calcio durante la fase de despolarización del potencial de acción es un proceso rápido, especialmente en la unión neuromuscular; Por lo tanto, para su registro, se requiere el equipo adecuado¹. Un estudio reciente que utilizó un tinte fluorescente sensible al voltaje demostró que la duración del potencial de acción en la sinapsis periférica de un ratón es de aproximadamente 300 μs²². El calcio transitorio, evaluado utilizando colorantes sensibles al calcio en las sinapsis periféricas de la rana, tiene una duración más larga: el tiempo de subida es de aproximadamente 2-6 ms y el tiempo de descomposición es de aproximadamente 30-90 ms, dependiendo del colorante de calcio utilizado^23,24. Para medir procesos rápidos con la ayuda de tintes fluorescentes, generalmente se utilizan cámaras CCD o CMOS, con matrices CCD rápidas y sensibles. Sin embargo, estas cámaras tienen la desventaja de baja resolución, limitada por el tamaño de los elementos sensibles de la matriz^25,26,27,28. Las cámaras más rápidas con sensibilidad suficiente para registrar tanto potenciales de acción como transitorios de calcio en respuesta a la estimulación de baja frecuencia de las células tienen una frecuencia de barrido de 2.000 Hz, y una matriz con una dimensión de 80 x 80²⁹. Para obtener señales con una mayor resolución espacial, se utiliza microscopía confocal, especialmente si es necesario evaluar algunos cambios volumétricos en la señal^30,31,32. Pero debe tenerse en cuenta que la microscopía confocal tiene una alta velocidad de escaneo en modo de escaneo en línea, pero todavía existen limitaciones significativas en la velocidad de grabación de procesos rápidos al construir una imagen espacial³³. Existen microscopios confocales basados en discos giratorios de Nipkow (microscopía de barrido de hendidura) y escáneres multipunto-array, que tienen una mayor velocidad de barrido. Al mismo tiempo, son inferiores a los microscopios confocales clásicos en el filtrado de imágenes confocales (diafonía estenopeica para microscopios con un disco de Nipkow)^32,34,35. La imagen confocal con escaneo de resonancia también puede proporcionar una alta resolución espacio-temporal requerida para mediciones temporales altas³⁶. Sin embargo, tenga en cuenta que el registro de respuestas fluorescentes débiles a una alta velocidad de escaneo cuando se utilizan escáneres de resonancia requiere detectores altamente sensibles como los detectores híbridos³⁶.

Este artículo presenta un método para aumentar la resolución temporal de las señales registradas con la Microscopía Confocal de Barrido Láser (LSCM) manteniendo la resolución espacial³⁷. El método actual es un desarrollo adicional de los métodos descritos anteriormente y transferidos a la plataforma LSCM^38,39,40. Este enfoque no requiere cambios en el hardware del microscopio y se basa en la aplicación de un algoritmo para registrar periódicamente señales fluorescentes evocadas con un cambio de tiempo relativo al momento de la estimulación.