Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

O problema da medição de ondas rápidas de cálcio em células excitáveis é um dos aspectos mais importantes e desafiadores do estudo da transmissão de sinais nos sistemas nervosos central e periférico. Os íons de cálcio desempenham um papel importante no desencadeamento da liberação de neurotransmissores, plasticidade sináptica e modulação da atividade de várias proteínas intracelulares 1,2,3,4,5. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas⁶. Para medir as alterações nos níveis de cálcio, corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio são comumente usados, e alterações no nível de fluorescência são analisadas ^7,8,9.

O carregamento de corantes de cálcio nas células pode ser alcançado de diferentes maneiras. Predominantemente, são utilizados corantes permeantes de células^10,11. No entanto, nesse caso, não é apenas difícil controlar a concentração de um corante dentro da célula, mas também é difícil selecionar células-alvo para carregamento. Este método não é aplicável para estudar terminações nervosas periféricas, uma vez que o corante entra em células postinásticas. Em vez disso, corantes impermecedulares celulares são mais adequados para tais preparações. Neste caso, os corantes são entregues às células por microinjeção ou através de uma pipeta de remendo 12,13,14. Há também um método de carregar através de um toco nervoso. Este último método é mais adequado para preparações de junção neuromuscular 15,16,17,18,19,20. Permite realizar a coloração apenas para células de interesse. Embora este método não forneça uma avaliação precisa da concentração do corante na célula-alvo, a concentração pode ser estimada aproximadamente comparando o nível de fluorescência das células em repouso em soluções com uma concentração conhecida de cálcio²¹. Neste estudo, é apresentada uma modificação desse método aplicado às sinapses dos mamíferos.

A entrada de cálcio durante a fase de despolarização do potencial de ação é um processo rápido, especialmente na junção neuromuscular; portanto, para seu registro, é necessário equipamento adequado¹. Um estudo recente usando um corante fluorescente sensível à tensão demonstrou que a duração do potencial de ação na sinapse periférica de um rato é de aproximadamente 300 μs²². O cálcio transitório, avaliado com corantes sensíveis ao cálcio nas sinapses periféricas do sapo, tem uma duração maior: o tempo de elevação é de cerca de 2-6 ms e o tempo de decomposição é de cerca de 30-90 ms, dependendo do corante de cálcio usado^23,24. Para medir processos rápidos com a ajuda de corantes fluorescentes, as câmeras CCD ou CMOS são geralmente utilizadas, com matrizes CCD rápidas e sensíveis. No entanto, essas câmeras têm a desvantagem da baixa resolução, limitada pelo tamanho dos elementos sensíveis da matriz 25,26,27,28. As câmeras mais rápidas com sensibilidade suficiente para registrar tanto potenciais de ação quanto transitórios de cálcio em resposta à estimulação de baixa frequência das células têm uma frequência de varredura de 2.000 Hz, e uma matriz com uma dimensão de 80 x 80²⁹. Para obter sinais com maior resolução espacial, é utilizada microscopia confocal, especialmente se for necessário avaliar algumas alterações volumosas no sinal 30,31,32. Mas deve-se ter em mente que a microscopia confocal tem uma alta velocidade de digitalização no modo de varredura de linha, mas ainda há limitações significativas na velocidade de gravações de processos rápidos ao construir uma imagem espacial³³. Existem microscópios confocal baseados em discos Nipkow rotativos (microscopia de varredura de fenda) e scanners multipoint-array, que têm uma velocidade de varredura mais alta. Ao mesmo tempo, eles são inferiores aos microscópios confocal clássicos na filtragem de imagem confocal (pinholes crosstalk para microscópios com um disco Nipkow)32,34,35. A imagem confocal com ressonância também pode fornecer uma alta resolução espátula-temporal necessária para altas medições temporais³⁶. No entanto, leve-se em conta que o registro de respostas fluorescentes fracas a uma alta velocidade de varredura ao usar scanners de ressonância requer detectores altamente sensíveis, como detectores híbridos³⁶.

Este artigo apresenta um método para aumentar a resolução temporal dos sinais registrados com a Microscopia Confocal de Varredura a Laser (LSCM) mantendo a resolução espacial³⁷. O método atual é um desenvolvimento adicional dos métodos descritos anteriormente e transferidos para a plataforma LSCM 38,39,40. Esta abordagem não requer alterações no hardware do microscópio e é baseada na aplicação de um algoritmo para gravação periodicamente de sinais fluorescentes evocados com uma mudança de tempo em relação ao momento de estimulação.