Регистрация переходных процессов кальция в нервно-мышечном соединении мыши с высоким временным разрешением с помощью конфокальной микроскопии

Проблема измерения быстрых кальциевых волн в возбудимых клетках является одним из важнейших и сложных аспектов изучения передачи сигнала в центральной и периферической нервной системе. Ионы кальция играют важную роль в запуске высвобождения нейромедиаторов, синаптической пластичности и модуляции активности различных внутриклеточных белков 1,2,3,4,5. Изучение передачи сигналов кальция также важно для поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний⁶. Для измерения изменений уровня кальция обычно используют флуоресцентные кальциечувствительные красители, а изменения уровня их флуоресценции анализируются ^7,8,9.

Загрузка кальциевых красителей в клетки может достигаться по-разному. Преимущественно используются клеточно-проницаемые красители^10,11. Однако в таком случае не только трудно контролировать концентрацию красителя внутри клетки, но и трудно выбрать клетки-мишени для загрузки. Этот метод не применим для изучения периферических нервных окончаний, так как краситель попадает в постсинаптические клетки. Вместо этого для таких препаратов больше подходят клеточные непроницаемые красители. В этом случае красители доставляются в клетки путем микроинъекции или через пластырную пипетку 12,13,14. Существует также метод загрузки через культю нерва. Последний способ наиболее подходит для препаратов нервно-мышечных соединений 15,16,17,18,19,20. Это позволяет выполнять окрашивание только для интересующих клеток. Хотя этот способ не обеспечивает точную оценку концентрации красителя в клетке-мишени, концентрацию можно оценить приблизительно путем сравнения уровня флуоресценции клеток в состоянии покоя в растворах с известной концентрацией кальция²¹. В данном исследовании представлена модификация данного метода, применяемая к синапсам млекопитающих.

Поступление кальция во время деполяризующей фазы потенциала действия происходит быстрым процессом, особенно в нервно-мышечном соединении; поэтому для его регистрации требуется соответствующее оборудование¹. Недавнее исследование с использованием чувствительного к напряжению флуоресцентного красителя показало, что продолжительность потенциала действия в периферическом синапсе мыши составляет примерно 300 мкс²². Кальций переходный, оцениваемый с помощью кальций-чувствительных красителей в периферических синапсах лягушки, имеет большую продолжительность: время нарастания составляет около 2-6 мс, а время распада составляет около 30-90 мс, в зависимости от используемого кальциевого красителя^23,24. Для измерения быстрых процессов с помощью флуоресцентных красителей обычно используются ПЗС- или КМОП-камеры с быстрыми и чувствительными ПЗС-матрицами. Однако эти камеры имеют недостаток низкого разрешения, ограниченного размерами чувствительных элементов матрицы 25,26,27,28. Самые быстрые камеры с достаточной чувствительностью для записи как потенциалов действия, так и переходных процессов кальция в ответ на низкочастотную стимуляцию клеток имеют частоту сканирования 2000 Гц, а матрицу с размерностью 80 х 80²⁹. Для получения сигналов с более высоким пространственным разрешением используется конфокальная микроскопия, особенно если необходимо оценить некоторые объемные изменения ^{сигнала} 30,31,32. Но следует иметь в виду, что конфокальная микроскопия имеет высокую скорость сканирования в режиме линейного сканирования, но все же существуют существенные ограничения на скорость записи быстрых процессов при построении пространственного изображения³³. Существуют конфокальные микроскопы на основе вращающихся дисков Нипкова (щелевая сканирующая микроскопия) и сканеры Multipoint-Array, которые имеют более высокую скорость сканирования. При этом они уступают классическим конфокальным микроскопам в конфокальной фильтрации изображений (точечные перекрестные помехи для микроскопов с диском Нипкова)32,34,35. Конфокальная визуализация с резонансным сканированием также может обеспечить высокое пространственно-временное разрешение, необходимое для высоких временных измерений³⁶. Однако учтите, что для регистрации слабых флуоресцентных откликов при высокой скорости сканирования при использовании резонансных сканеров требуются высокочувствительные детекторы, такие как гибридные детекторы³⁶.

В данной статье представлен метод увеличения временного разрешения сигналов, записанных с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) при сохранении пространственного разрешения³⁷. Текущий метод является дальнейшим развитием методов, описанных ранее и перенесенных на платформу LSCM 38,39,40. Такой подход не требует изменений в аппаратном обеспечении микроскопа и основан на применении алгоритма записи периодически вызываемых флуоресцентных сигналов со сдвигом времени относительно момента стимуляции.