Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Il problema di misurare le onde veloci di calcio nelle cellule eccitabili è uno degli aspetti più importanti e impegnativi dello studio della trasmissione del segnale nel sistema nervoso centrale e periferico. Gli ioni calcio svolgono un ruolo importante nell’innescare il rilascio di neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la modulazione dell’attività di varie proteine intracellulari 1,2,3,4,5. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative⁶. Per misurare i cambiamenti nei livelli di calcio, i coloranti fluorescenti sensibili al calcio sono comunemente usati e i cambiamenti nel loro livello di fluorescenza sono analizzati ^7,8,9.

Il caricamento di coloranti di calcio nelle cellule può essere ottenuto in diversi modi. Principalmente, i coloranti cellula-permeant sono usati^10,11. Tuttavia, in tal caso, non è solo difficile controllare la concentrazione di un colorante all’interno della cellula, ma è anche difficile selezionare le cellule bersaglio per il caricamento. Questo metodo non è applicabile per lo studio delle terminazioni nervose periferiche poiché il colorante entra nelle cellule postsinaptiche. Invece, i coloranti impermeant cellulari sono più adatti per tali preparazioni. In questo caso, i coloranti vengono consegnati alle cellule mediante microiniezione o attraverso una pipetta patch^12,13,14. C’è anche un metodo di caricamento attraverso un moncone nervoso. Quest’ultimo metodo è più adatto per le preparazioni della giunzione neuromuscolare 15,16,17,18,19,20. Permette di eseguire la colorazione solo per le cellule di interesse. Sebbene questo metodo non fornisca una valutazione accurata della concentrazione del colorante nella cellula bersaglio, la concentrazione può essere stimata approssimativamente confrontando il livello di fluorescenza delle cellule a riposo in soluzioni con una concentrazione nota di calcio²¹. In questo studio, viene presentata una modifica di questo metodo applicato alle sinapsi dei mammiferi.

L’ingresso di calcio durante la fase depolarizzante del potenziale d’azione è un processo veloce, specialmente nella giunzione neuromuscolare; Pertanto, per la sua registrazione, è necessaria un’attrezzatura appropriata¹. Un recente studio che utilizza un colorante fluorescente sensibile alla tensione ha dimostrato che la durata del potenziale d’azione nella sinapsi periferica di un topo è di circa 300 μs²². Il calcio transitorio, valutato utilizzando coloranti calcio-sensibili nelle sinapsi periferiche della rana, ha una durata maggiore: il tempo di salita è di circa 2-6 ms e il tempo di decadimento è di circa 30-90 ms, a seconda del colorante di calcio utilizzato^23,24. Per misurare processi veloci con l’aiuto di coloranti fluorescenti, vengono generalmente utilizzate telecamere CCD o CMOS, con matrici CCD veloci e sensibili. Tuttavia, queste telecamere hanno lo svantaggio della bassa risoluzione, limitata dalla dimensione degli elementi sensibili della matrice^25,26,27,28. Le telecamere più veloci con sensibilità sufficiente per registrare sia i potenziali d’azione che i transitori di calcio in risposta alla stimolazione a bassa frequenza delle cellule hanno una frequenza di scansione di 2.000 Hz e una matrice con una dimensione di 80 x 80²⁹. Per ottenere segnali con una risoluzione spaziale più elevata, viene utilizzata la microscopia confocale, soprattutto se è necessario valutare alcune variazioni volumetriche nel segnale^30,31,32. Ma va tenuto presente che la microscopia confocale ha un’alta velocità di scansione in modalità di scansione lineare, ma ci sono ancora limitazioni significative sulla velocità delle registrazioni di processi veloci quando si costruisce un’immagine spaziale³³. Esistono microscopi confocali basati su dischi Nipkow rotanti (microscopia a scansione a fessura) e scanner multipoint-array, che hanno una maggiore velocità di scansione. Allo stesso tempo, sono inferiori ai microscopi confocali classici nel filtraggio delle immagini confocali (diafonia forica per microscopi con un disco di Nipkow)^32,34,35. L’imaging confocale con scansione a risonanza può anche fornire un’elevata risoluzione spazio-temporale richiesta per misurazioni temporali elevate³⁶. Tuttavia, tenere conto del fatto che la registrazione di risposte fluorescenti deboli ad alta velocità di scansione quando si utilizzano scanner a risonanza richiede rivelatori altamente sensibili come i rilevatori ibridi³⁶.

Questo articolo presenta un metodo per aumentare la risoluzione temporale dei segnali registrati con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) mantenendo la risoluzione spaziale³⁷. Il metodo attuale è un ulteriore sviluppo dei metodi descritti in precedenza e trasferiti alla piattaforma LSCM^38,39,40. Questo approccio non richiede modifiche nell’hardware del microscopio e si basa sull’applicazione di un algoritmo per la registrazione di segnali fluorescenti periodicamente evocati con uno spostamento temporale rispetto al momento della stimolazione.