Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

Het probleem van het meten van snelle calciumgolven in prikkelbare cellen is een van de belangrijkste en meest uitdagende aspecten van het bestuderen van signaaloverdracht in het centrale en perifere zenuwstelsel. Calciumionen spelen een belangrijke rol bij het activeren van de afgifte van neurotransmitters, synaptische plasticiteit en modulatie van de activiteit van verschillende intracellulaire eiwitten 1,2,3,4,5. Het bestuderen van calciumsignalering is ook belangrijk voor het vinden van manieren om neurodegeneratieve ziekten te behandelen⁶. Om veranderingen in de calciumspiegels te meten, worden vaak fluorescerende calciumgevoelige kleurstoffen gebruikt en worden veranderingen in hun fluorescentieniveau geanalyseerd ^7,8,9.

Het laden van calciumkleurstoffen in cellen kan op verschillende manieren worden bereikt. Overwegend worden celpermeante kleurstoffen gebruikt^10,11. In een dergelijk geval is het echter niet alleen moeilijk om de concentratie van een kleurstof in de cel te regelen, maar het is ook moeilijk om doelcellen te selecteren om te laden. Deze methode is niet van toepassing op het bestuderen van perifere zenuwuiteinden, omdat de kleurstof postsynaptische cellen binnendringt. In plaats daarvan zijn celondoorlatende kleurstoffen meer geschikt voor dergelijke preparaten. In dit geval worden de kleurstoffen aan de cellen geleverd door micro-injectie of via een patchpipet 12,13,14. Er is ook een methode om door een zenuwstomp te laden. De laatste methode is het meest geschikt voor neuromusculaire junctiepreparaten 15,16,17,18,19,20. Het maakt het mogelijk om kleuring uit te voeren voor alleen cellen van belang. Hoewel deze methode geen nauwkeurige evaluatie geeft van de concentratie van de kleurstof in de doelcel, kan de concentratie ongeveer worden geschat door het fluorescentieniveau van de cellen in rust in oplossingen te vergelijken met een bekende concentratie calcium²¹. In deze studie wordt een wijziging van deze methode toegepast op synapsen van zoogdieren gepresenteerd.

Calciuminvoer tijdens de depolariserende fase van het actiepotentiaal is een snel proces, vooral in de neuromusculaire overgang; daarom is voor de registratie ervan geschikte apparatuur vereist¹. Een recente studie met behulp van een spanningsgevoelige fluorescerende kleurstof toonde aan dat de duur van de actiepotentiaal in de perifere synaps van een muis ongeveer 300 μs²² is. Calciumtransiënt, geëvalueerd met behulp van calciumgevoelige kleurstoffen in de perifere synapsen van de kikker, heeft een langere duur: de stijgingstijd is ongeveer 2-6 ms en de vervaltijd is ongeveer 30-90 ms, afhankelijk van de gebruikte calciumkleurstof^23,24. Om snelle processen te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen, worden over het algemeen CCD- of CMOS-camera’s gebruikt, met snelle en gevoelige CCD-matrices. Deze camera’s hebben echter het nadeel van een lage resolutie, beperkt door de grootte van de gevoelige elementen van de matrix 25,26,27,28. De snelste camera’s met voldoende gevoeligheid om zowel actiepotentialen als calciumtransiënten vast te leggen als reactie op laagfrequente stimulatie van cellen hebben een scanfrequentie van 2.000 Hz en een matrix met een afmeting van 80 x 80²⁹. Om signalen met een hogere ruimtelijke resolutie te verkrijgen, wordt confocale microscopie gebruikt, vooral als het nodig is om enkele volumetrische veranderingen in het signaal 30,31,32 te beoordelen. Maar er moet rekening mee worden gehouden dat confocale microscopie een hoge scansnelheid heeft in de lijnscanmodus, maar er zijn nog steeds aanzienlijke beperkingen op de snelheid van opnames van snelle processen bij het bouwen van een ruimtelijk beeld³³. Er zijn confocale microscopen op basis van roterende Nipkow-schijven (spleetscanmicroscopie) en Multipoint-Array Scanners, die een hogere scansnelheid hebben. Tegelijkertijd zijn ze inferieur aan de klassieke confocale microscopen in confocale beeldfiltering (pinholes crosstalk voor microscopen met een Nipkow-schijf)32,34,35. Confocale beeldvorming met resonantiescanning kan ook een hoge spatio-temporele resolutie bieden die vereist is voor hoge temporele metingen³⁶. Houd er echter rekening mee dat de registratie van zwakke fluorescentieresponsen bij een hoge scansnelheid bij gebruik van resonantiescanners zeer gevoelige detectoren vereist, zoals hybride detectoren³⁶.

Dit artikel presenteert een methode voor het verhogen van de temporele resolutie van signalen die zijn opgenomen met de Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) met behoud van de ruimtelijke resolutie³⁷. De huidige methode is een doorontwikkeling van de eerder beschreven methoden en overgezet naar het LSCM-platform 38,39,40. Deze aanpak vereist geen veranderingen in de microscoophardware en is gebaseerd op de toepassing van een algoritme voor het opnemen van periodiek opgeroepen fluorescentiesignalen met een tijdverschuiving ten opzichte van het moment van stimulatie.