JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
français

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

Published: December 01, 2021
doi:
10.3791/63308
, , , ,
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes,Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies,Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology,Kazan State Medical University

Summary

Le protocole décrit la méthode de chargement d’un colorant calcique fluorescent à travers le nerf coupé dans les terminaisons nerveuses motrices de souris. En outre, une méthode unique d’enregistrement rapide des transitoires de calcium dans les terminaisons nerveuses périphériques à l’aide de la microscopie confocale est présentée.

Abstract

L’estimation du taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique, car l’entrée de calcium dans la cellule présynaptique déclenche une cascade d’événements conduisant à la libération de neurotransmetteurs. De plus, les changements dans les niveaux de calcium présynaptique médient l’activité de nombreuses protéines intracellulaires et jouent un rôle important dans la plasticité synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. La jonction neuromusculaire est un modèle approprié pour étudier la plasticité synaptique, car elle n’a qu’un seul type de neurotransmetteur. Cet article décrit la méthode de chargement d’un colorant sensible au calcium à travers le faisceau nerveux coupé dans les terminaisons nerveuses motrices des souris. Cette méthode permet l’estimation de tous les paramètres liés aux changements intracellulaires du calcium, tels que le taux de calcium basal et le calcium transitoire. Étant donné que l’afflux de calcium de l’extérieur de la cellule dans les terminaisons nerveuses et sa liaison / déliaison au colorant sensible au calcium se produisent dans un délai de quelques millisecondes, un système d’imagerie rapide est nécessaire pour enregistrer ces événements. En effet, les caméras à haute vitesse sont couramment utilisées pour l’enregistrement des changements rapides du calcium, mais elles ont des paramètres de faible résolution d’image. Le protocole présenté ici pour l’enregistrement transitoire du calcium permet une très bonne résolution spatio-temporelle fournie par la microscopie confocale.

Introduction

Le problème de la mesure des ondes de calcium rapides dans les cellules excitables est l’un des aspects les plus importants et les plus difficiles de l’étude de la transmission du signal dans les systèmes nerveux central et périphérique. Les ions calcium jouent un rôle important dans le déclenchement de la libération de neurotransmetteurs, la plasticité synaptique et la modulation de l’activité de diverses protéines intracellulaires 1,2,3,4,5. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives6. Pour mesurer les changements dans les niveaux de calcium, des colorants fluorescents sensibles au calcium sont couramment utilisés, et les changements dans leur niveau de fluorescence sont analysés 7,8,9.

Le chargement des colorants calciques dans les cellules peut être réalisé de différentes manières. Principalement, les colorants perméables aux cellules sont utilisés10,11. Cependant, dans un tel cas, il est non seulement difficile de contrôler la concentration d’un colorant à l’intérieur de la cellule, mais il est également difficile de sélectionner les cellules cibles pour le chargement. Cette méthode n’est pas applicable à l’étude des terminaisons nerveuses périphériques puisque le colorant pénètre dans les cellules postsynaptiques. Au lieu de cela, les colorants imperméables cellulaires conviennent mieux à de telles préparations. Dans ce cas, les colorants sont délivrés aux cellules par micro-injection ou par une pipette patch12,13,14. Il existe également une méthode de chargement à travers un moignon nerveux. Cette dernière méthode est la plus appropriée pour les préparations de jonction neuromusculaire 15,16,17,18,19,20. Il permet d’effectuer des colorations uniquement pour les cellules d’intérêt. Bien que cette méthode ne fournisse pas une évaluation précise de la concentration du colorant dans la cellule cible, la concentration peut être estimée approximativement en comparant le niveau de fluorescence des cellules au repos dans des solutions avec une concentration connue de calcium21. Dans cette étude, une modification de cette méthode appliquée aux synapses des mammifères est présentée.

L’entrée du calcium pendant la phase dépolarisante du potentiel d’action est un processus rapide, en particulier dans la jonction neuromusculaire; Par conséquent, pour son enregistrement, un équipement approprié est nécessaire1. Une étude récente utilisant un colorant fluorescent sensible à la tension a démontré que la durée du potentiel d’action dans la synapse périphérique d’une souris est d’environ 300 μs22. Le calcium transitoire, évalué à l’aide de colorants sensibles au calcium dans les synapses périphériques de la grenouille, a une durée plus longue: le temps de montée est d’environ 2-6 ms et le temps de désintégration est d’environ 30-90 ms, selon le colorant calcique utilisé23,24. Pour mesurer des processus rapides à l’aide de colorants fluorescents, des caméras CCD ou CMOS sont généralement utilisées, avec des matrices CCD rapides et sensibles. Cependant, ces caméras présentent l’inconvénient d’une faible résolution, limitée par la taille des éléments sensibles de la matrice25,26,27,28. Les caméras les plus rapides avec une sensibilité suffisante pour enregistrer à la fois les potentiels d’action et les transitoires de calcium en réponse à la stimulation à basse fréquence des cellules ont une fréquence de balayage de 2 000 Hz et une matrice d’une dimension de 80 x 8029. Pour obtenir des signaux avec une résolution spatiale plus élevée, la microscopie confocale est utilisée, surtout s’il est nécessaire d’évaluer certains changements volumétriques dans le signal30,31,32. Mais il faut garder à l’esprit que la microscopie confocale a une vitesse de balayage élevée en mode balayage linéaire, mais il existe encore des limitations importantes à la vitesse d’enregistrement des processus rapides lors de la construction d’une image spatiale33. Il existe des microscopes confocaux basés sur des disques de Nipkow rotatifs (microscopie à balayage à fente) et des scanners multipoints, qui ont une vitesse de balayage plus élevée. En même temps, ils sont inférieurs aux microscopes confocaux classiques dans le filtrage d’images confocales (diaphonie de trous d’épingle pour les microscopes avec un disque de Nipkow)32,34,35. L’imagerie confocale avec balayage par résonance peut également fournir une résolution spatio-temporelle élevée requise pour des mesures temporelles élevées36. Toutefois, il faut tenir compte du fait que l’enregistrement de faibles réponses fluorescentes à une vitesse de balayage élevée lors de l’utilisation de scanners à résonance nécessite des détecteurs très sensibles tels que les détecteurs hybrides36.

Cet article présente une méthode permettant d’augmenter la résolution temporelle des signaux enregistrés avec la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) tout en maintenant la résolution spatiale37. La méthode actuelle est un développement ultérieur des méthodes décrites précédemment et transférées à la plate-forme LSCM38,39,40. Cette approche ne nécessite pas de modifications du matériel du microscope et est basée sur l’application d’un algorithme pour enregistrer des signaux fluorescents évoqués périodiquement avec un décalage temporel par rapport au moment de la stimulation.

Protocol

Des expériences ont été réalisées sur des préparations isolées de muscles nerveux de releveur auris longus (m. LAL) provenant de souris BALB/C (20-23 g, 2-3 mois)41. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université fédérale de Kazan et de l’Université médicale de Kazan, conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole exp?…

Representative Results

Après chargement de la préparation avec un colorant selon la technique présentée, la plupart des synapses situées à proximité du moignon nerveux présentaient un niveau de fluorescence suffisant (voir Figure 2). Après chargement de la préparation avec le colorant et application de la méthode décrite d’enregistrement et de traitement de l’image, on a obtenu des transitoires calciques avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée (voir figure 4</stro…

Discussion

La méthode de chargement d’un colorant sensible au Ca2+ dans les terminaisons nerveuses de souris à travers le moignon nerveux et d’enregistrement d’un transitoire calcique rapide à l’aide d’un microscope confocal est présentée dans cet article. À la suite de la mise en œuvre de cette méthode de charge, la plupart des synapses situées près du moignon nerveux avaient un niveau de fluorescence suffisant pour permettre l’enregistrement de l’entrée du calcium dans les terminaisons nerveuse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les études de fluorescence de ces travaux ont été réalisées avec le soutien financier de la subvention de la Fondation scientifique russe (projet n ° 19-15-00329). La méthode a été développée grâce au financement de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La recherche a été développée avec l’utilisation de l’équipement du Centre fédéral de recherche « Kazan Scientific Center of RAS ». Les auteurs tiennent à remercier le Dr Victor I. Ilyin pour la lecture critique de ce manuscrit.

Materials

Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. – No. 9 (40) Part 3. – P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  30. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  31. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , (2011).
  32. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  33. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  34. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  35. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  36. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  37. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  38. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  39. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  40. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  41. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  42. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
  43. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  44. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  46. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
  47. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
  48. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  49. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  50. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  51. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  52. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  53. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
  54. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
  55. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  56. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Tags

Calcium TransientsNeuromuscular JunctionConfocal MicroscopyPresynaptic CalciumSynaptic TransmissionCalcium SignalingNeurodegenerative DiseasesLoading TechniqueSpatial-temporal ResolutionConfocal MicroscopeNerve TrunkNerve StumpDye Loading Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image