共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

興奮性細胞における高速カルシウム波を測定する問題は、中枢神経系および末梢神経系におけるシグナル伝達を研究する上で最も重要かつ困難な側面の1つです。カルシウムイオンは、神経伝達物質の放出、シナプス可塑性、およびさまざまな細胞内タンパク質の活性の調節を引き起こすのに重要な役割を果たします1,2,3,4,5。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です⁶。カルシウムレベルの変化を測定するために、蛍光カルシウム感受性色素が一般的に使用され、それらの蛍光レベルの変化が分析されます^7、8、9。

カルシウム色素の細胞への装填は、さまざまな方法で達成できます。主に、細胞透過性染料が使用される^10,11。しかし、このような場合、細胞内の色素の濃度を制御することが難しいだけでなく、ロードする標的細胞を選択することも困難である。この方法は、色素がシナプス後細胞に入るため、末梢神経終末の研究には適用できません。代わりに、細胞不透過性染料がそのような調製物により適している。この場合、色素は、マイクロインジェクションによって、またはパッチピペット^12、13、14を介して細胞に送達される。神経断端を通して負荷をかける方法もあります。後者の方法は、神経筋接合部調製物¹⁵、16、¹⁷、¹⁸、^19、20に最も適している。目的の細胞に対してのみ染色を行うことができます。この方法では、標的細胞中の色素の濃度を正確に評価することはできませんが、濃度は、溶液中の安静細胞の蛍光レベルを既知の濃度のカルシウム²¹と比較することによっておおよそ推定できます。本研究では、哺乳類のシナプスに適用されるこの方法の修正を提示する。

活動電位の脱分極期におけるカルシウムの侵入は、特に神経筋接合部において速いプロセスである。したがって、その登録には、適切な機器が必要です¹。電位感受性蛍光色素を用いた最近の研究では、マウスの末梢シナプスにおける活動電位の持続時間は約300μsであることが実証された²²。カエルの末梢シナプスでカルシウム感受性染料を使用して評価されたカルシウム過渡性は、より長い持続時間を有する:上昇時間は約2〜6ミリ秒であり、崩壊時間は約30〜90ミリ秒である^23,24。蛍光色素を使用して高速プロセスを測定するには、CCDまたはCMOSカメラが一般的に使用され、高速で感度の高いCCDマトリックスが使用されます。しかしながら、これらのカメラは、マトリックス²⁵、^26、27、28の敏感な要素のサイズによって制限される低解像度の欠点を有する。細胞の低周波刺激に応答して活動電位とカルシウム過渡現象の両方を記録するのに十分な感度を有する最速のカメラは、2,000Hzのスキャン周波数を有し、80×80の寸法を有するマトリックスを有する²⁹。より高い空間分解能を有する信号を得るために、特に信号^30、31、³²におけるいくらかの体積変化を評価する必要がある場合には^、共焦点顕微鏡が使用される。しかし、共焦点顕微鏡はラインスキャンモードでは高いスキャン速度を有するが、空間画像³³を構築する際の高速プロセスの記録速度には依然として大きな制限があることに留意すべきである。回転するニプコウディスクをベースにした共焦点顕微鏡(スリット走査顕微鏡)や、より高速なスキャン速度を持つマルチポイントアレイスキャナーがあります。同時に、それらは共焦点画像フィルタリング(ニポウディスクを備えた顕微鏡のピンホールクロストーク)において古典的な共焦点顕微鏡より劣っています^32,34,35。共鳴スキャンによる共焦点画像化はまた、高時間測定に必要な高い時空間分解能を提供することができる³⁶。しかしながら、共鳴スキャナを使用する場合、高速走査速度での弱い蛍光応答の登録には、ハイブリッド検出器³⁶などの高感度検出器が必要であることを考慮する。

本稿では、空間分解能を維持しながら、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で記録された信号の時間分解能を高める方法を紹介します³⁷。現在の方法は、前述の方法のさらなる発展であり、LSCMプラットフォーム³⁸、^39、40に転送される。このアプローチは、顕微鏡ハードウェアの変更を必要とせず、刺激の瞬間に対する時間シフトで周期的に誘発される蛍光シグナルを記録するためのアルゴリズムの適用に基づいています。