Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un vettore doppio virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale

Mentre la SCI è un evento relativamente raro nella popolazione pediatrica, è particolarmente traumatica e causa una disabilità permanente che richiede un’immensa lungimiranza logistica. Inoltre, una percentuale maggiore di SCI pediatrici è classificata come cervicale e completa rispetto alla popolazione adulta ^1,2. Un segno distintivo tra le specie di mammiferi è che i neonati guariscono notevolmente meglio dalla SCI rispetto agli adulti, e questo offre l’opportunità di valutare i meccanismi trainanti per il recupero nelle popolazioni più giovani ^3,4,5. Nonostante ciò, ci sono meno studi multimodali che affrontano la ricerca sui neonati e sui roditori infantili, in parte a causa della difficoltà aggiuntiva di indirizzare con precisione popolazioni selezionate di neuroni nei punti di riferimento anatomici molto più stretti degli animali più giovani⁶. Questo articolo si concentra sull’iniezione diretta di vettori adeno-associati anterogradi e retrogradi altamente efficienti nel midollo spinale del ratto per modulare le principali vie motorie con l’applicazione di Cre-dipendenti-DREADD, espandendo la portata degli studi di rigenerazione multimodale.

I vettori virali sono importanti strumenti biologici con un’ampia gamma di applicazioni, tra cui l’introduzione di materiale genetico per sostituire i geni bersaglio, sovraregolare le proteine della crescita e tracciare il paesaggio anatomico del SNC ^7,8,9. Molti dei dettagli anatomici delle vie motorie spinali sono stati studiati utilizzando traccianti classici, cioè ammina destrana biotinilata. Mentre i traccianti tradizionali sono stati determinanti nel portare alla luce la neuroanatomia, non sono privi di svantaggi: etichettano indiscriminatamente i percorsi anche se iniettati correttamente, e gli studi hanno scoperto che sono assorbiti dagli assoni danneggiati^10,11,12. Di conseguenza, ciò potrebbe portare a interpretazioni errate negli studi di rigenerazione in cui gli assoni recisi potrebbero essere scambiati per fibre rigeneranti.

Il seguente metodo utilizza il sistema di vettori bivirali recentemente reso popolare negli studi di modulazione, con due diversi vettori virali in due aree separate dello stesso neurone^13,14. Il primo è un vettore che infetta localmente i corpi cellulari dei neuroni di proiezione. L’altro è un vettore retrogrado trasportato dai terminali assoni dei neuroni di proiezione (Figura 1). Il vettore retrogrado porta Cre ricombinasi, e il vettore locale incorpora la sequenza “Cre-On” a doppio floxed in cui è codificata una proteina fluorescente (mCherry). Il transgene nativo che esprime sia hM3Dq che mCherry è invertito rispetto al promotore ed è affiancato da due siti LoxP (Figura 2). Pertanto, mCherry è espresso solo nei neuroni di proiezione doppiamente trasdotti in cui Cre ricombinasi induce un evento di ricombinazione tra i siti LoxP, capovolgendo l’orientamento del transgene nel frame di lettura appropriato e consentendo l’espressione sia del DREADD che della proteina fluorescente. Una volta che il transgene virale è nell’orientamento corretto, e quando applicabile, i DREADD possono indurre transitoriamente la neuromodulazione attraverso un ligando iniettato separatamente, cioè clozapina-N-ossido. Il protocollo è stato progettato per autenticare la ricerca sulla neuromodulazione inducibile nei neonati, in cui DREADDS viene iniettato per modulare selettivamente i CST. Il sistema a due virali funge da polizza assicurativa, garantendo che ogni cellula positiva al DREADD sia tracciabile sotto fluorescenza con alta fedeltà per convalidare le iniezioni.

Questo metodo aiuta anche a colmare il divario nella ricerca neonatale. La SCI pediatrica presenta le sue sfide e la ricerca che analizza la rigenerazione, la germinazione o la plasticità dovrebbe enfatizzare le differenze tra neonati e adulti 3,15,16,17. Ottimizzando la procedura chirurgica ed eseguendo studi anatomici precedenti con colorazione Nissl, sono state convalidate le coordinate per entrambe le iniezioni craniche e spinali. L’obiettivo era quello di fornire un metodo per doppie iniezioni in un ratto neonatale con maggiore fedeltà e capacità di sopravvivenza.

Per il modello attuale, il vettore anterogrado è stato iniettato nei corpi cellulari della corteccia somatomotoria utilizzando il bregma come riferimento^18,19. In termini di iniezioni spinali, il vettore retrogrado è stato iniettato nelle lamine V-VII, dove i terminali assoni CST risiedono^20,21. Ci sono molte domande fondamentali alla base di come alcuni modelli di lesione influenzano gli animali più giovani in modo diverso e come il successivo recupero diverge da un animale più anziano. Questo studio dimostra un robusto mezzo per studiare le lesioni cervicali e la recuperabilità della funzione degli arti anteriori nei roditori neonatali. Al contrario, la maggior parte degli studi precedenti ha affrontato il recupero della locomozione a seguito di lesioni lombari o toraciche 5,22,23,24. Accoppiando il vettore a doppio virus con la nuova tecnica di iniezione qui descritta, questo protocollo aiuta a mitigare alcuni problemi (cioè la sopravvivenza) che possono affliggere le indagini sui roditori neonatali. Questo metodo è robusto, pratico e versatile: lievi variazioni nella tecnica consentiranno di indirizzare diversi percorsi, ad esempio CST ventrale, CST dorsale e percorsi dorsali ascendenti.

Per questo sistema, un virus ad azione locale (ad esempio, AAV2) viene iniettato nella regione dei corpi cellulari neuronali di interesse. Un secondo virus trasportato retrogradamente che controlla l’espressione del virus locale viene iniettato ai terminali assoni per quella popolazione neuronale. Quindi, per definizione, solo i neuroni corticospinali sono etichettati. Il virus retroAAV-Cre è stato scelto con un promotore CMV costitutivamente attivo in quanto il plasmide shuttle viene utilizzato per generare diversi sierotipi AAV per l’espressione Cre-dipendente in diversi tipi cellulari. Per le iniezioni corticali, AAV2 è stato scelto con il transgene guidato dal promotore sinapsina-1 per limitare qualsiasi espressione ai neuroni. Poiché il sistema 2-virale si basa maggiormente sull’origine e sulla cessazione della popolazione neuronale di interesse, potrebbero essere utilizzati diversi promotori, se possono guidare l’espressione dei geni di interesse all’interno della popolazione neuronale di interesse. Ad esempio, il promotore neuronale eccitatorio, CamKII, potrebbe essere sostituito per la sinapsina-1. Oltre all’uso di questi sierotipi AAV, il trasporto retrogrado nei motoneuroni corticospinali adulti può anche essere ottenuto utilizzando l’alto lentivirus trasportabile retrogrado (HiRet)²⁵. I lentivirus HiRet utilizzano una glicoproteina chimerica di rabbia / VSV per indirizzare l’assorbimento alla sinapsi per il trasporto retrogrado. In combinazione con un promotore Tet-On, questo sistema 2-virale supporta l’espressione inducibile in modo retrogrado-dipendente^26,27.

I virus retrogradi inseriscono vettori nello spazio sinaptico di un neurone bersaglio, permettendogli di essere assorbito dall’assone di quella cellula e trasportato al corpo cellulare. Mentre i vettori lentivirali hanno avuto in precedenza un enorme successo, fornendo espressione a lungo termine negli studi di terapia genica, questo metodo ha ruotato verso i vettori virali adeno-associati per alcune semplici ragioni^26,28: AAV è più economico, altrettanto efficace e presenta meno di un onere logistico, dato che ha una designazione di livello di biosicurezza inferiore 29,30,31,32 . Mentre AAV2, il sierotipo più utilizzato, dimostra una robusta trasfezione degli assoni CST, i futuri ricercatori potrebbero notare che AAV1 offre una certa versatilità in quanto etichetta transynapticamente, mettendo così diverse possibili iterazioni in studi futuri³³. L’adattamento finale consiste nel codificare il virus retrogrado con Cre-ricombinasi in modo che più vettori anterogradi possano essere introdotti contemporaneamente, riducendo così gli sprechi di virus interni non necessari e massimizzando la probabilità che i DREADD si esprimano nell’orientamento corretto.

In definitiva, questo protocollo dimostra l’iniezione simultanea nella corteccia e nella colonna cervicale, mirando in particolare ai corpi cellulari e ai terminali assoni del tratto corticospinale, rispettivamente. La trasfezione ad alta fedeltà è visibile nella corteccia cerebrale e nel midollo spinale. Mentre il protocollo descritto è stato perfezionato per ratti Sprague Dawley di 5 giorni di età, è adatto per i giorni postnatali 4-10 con piccoli aggiustamenti all’anestesia e alle coordinate stereotassiche.