Cibler le tractus corticospinal chez les rats néonatals avec un vecteur double viral à l’aide d’une chirurgie combinée du cerveau et de la colonne vertébrale

Bien que l’ICS soit relativement rare dans la population pédiatrique, elle est particulièrement traumatisante et entraîne une invalidité permanente nécessitant une immense prévoyance logistique. De plus, une proportion plus élevée de lésions médullaires pédiatriques est classée comme cervicale et complète par rapport à la population adulte ^1,2. Une caractéristique des espèces de mammifères est que les nouveau-nés se rétablissent nettement mieux de la lésion médullaire que les adultes, ce qui offre l’occasion d’évaluer les mécanismes moteurs du rétablissement dans les populations plus jeunes ^3,4,5. Malgré cela, il y a moins d’études multimodales abordant la recherche sur les rongeurs nouveau-nés et infantiles, en partie en raison de la difficulté supplémentaire de cibler avec précision certaines populations de neurones dans les repères anatomiques beaucoup plus serrés des jeunes animaux⁶. Cet article se concentre sur l’injection directe de vecteurs adéno-associés antérogrades et rétrogrades hautement efficaces dans la moelle épinière du rat pour moduler les principales voies motrices avec l’application de Cre-dépendant-DREADDs, élargissant ainsi la portée des études de régénération multimodale.

Les vecteurs viraux sont des outils biologiques importants avec un large éventail d’applications, y compris l’introduction de matériel génétique pour remplacer les gènes cibles, réguler à la hausse les protéines de croissance et tracer le paysage anatomique du SNC ^7,8,9. De nombreux détails anatomiques des voies motrices de la colonne vertébrale ont été étudiés à l’aide de traceurs classiques, c’est-à-dire l’amine de dextrane biotinylée. Bien que les traceurs traditionnels aient joué un rôle déterminant dans la découverte de la neuroanatomie, ils ne sont pas sans inconvénients: ils marquent indistinctement les voies même s’ils sont correctement injectés, et des études ont montré qu’ils sont absorbés par des axones endommagés^10,11,12. Par conséquent, cela pourrait conduire à des interprétations incorrectes dans les études de régénération où les axones sectionnés pourraient être confondus avec des fibres régénérantes.

La méthode suivante utilise le système de vecteurs biviraux récemment popularisé dans les études de modulation, avec deux vecteurs viraux différents dans deux zones distinctes du même neurone^13,14. Le premier est un vecteur qui infecte localement les corps cellulaires des neurones de projection. L’autre est un vecteur rétrograde transporté depuis les terminaisons axonales des neurones de projection (Figure 1). Le vecteur rétrograde porte la Cre recombinase, et le vecteur local incorpore la séquence à double flox « Cre-On » dans laquelle une protéine fluorescente (mCherry) est codée. Le transgène natif exprimant à la fois hM3Dq et mCherry est inversé par rapport au promoteur et est flanqué de deux sites LoxP (Figure 2). Ainsi, mCherry n’est exprimé que dans les neurones de projection doublement transduits où la Cre recombinase induit un événement de recombinaison entre les sites LoxP, inversant l’orientation du transgène dans le cadre de lecture approprié et permettant l’expression à la fois du DREADD et de la protéine fluorescente. Une fois que le transgène viral est dans la bonne orientation, et le cas échéant, les DREADDs peuvent induire transitoirement une neuromodulation par le biais d’un ligand injecté séparément, c’est-à-dire la clozapine-N-oxyde. Le protocole a été conçu pour authentifier la recherche sur la neuromodulation inductible chez les nouveau-nés, dans laquelle des DREADDS sont injectés pour moduler les CST de manière sélective. Le système biviral agit comme une police d’assurance, garantissant que chaque cellule DREADD-positive est traçable sous fluorescence avec une haute fidélité pour valider les injections.

Cette méthode aide également à combler les lacunes dans la recherche néonatale. La lésion médullaire pédiatrique présente ses défis, et la recherche analysant la régénération, la germination ou la plasticité devrait mettre l’accent sur les différences entre les nouveau-nés et les adultes 3,15,16,17. En optimisant l’intervention chirurgicale et en réalisant des études anatomiques préalables avec coloration Nissl, les coordonnées des injections crâniennes et vertébrales ont été validées. L’objectif était de fournir une méthode d’injections doubles chez un rat nouveau-né avec une fidélité et une capacité de survie accrues.

Pour le modèle actuel, le vecteur antérograde a été injecté dans les corps cellulaires du cortex somatomoteur en utilisant le bregma comme référence^18,19. En ce qui concerne les injections vertébrales, le vecteur rétrograde a été injecté dans les lames V-VII, où résident les terminaux axonaux CST^20,21. De nombreuses questions fondamentales sous-tendent la façon dont certains modèles de lésions affectent différemment les jeunes animaux et comment le rétablissement ultérieur diverge d’un animal plus âgé. Cette étude démontre un moyen robuste d’étudier les lésions cervicales et la récupérabilité de la fonction des membres antérieurs chez les rongeurs néonatals. En revanche, la majorité des études antérieures ont porté sur la locomotion de récupération à la suite de blessures lombaires ou thoraciques 5,22,23,24. En associant le vecteur double viral à la nouvelle technique d’injection décrite ici, ce protocole aide à atténuer certains problèmes (c.-à-d. la capacité de survie) qui peuvent nuire aux enquêtes néonatales sur les rongeurs. Cette méthode est robuste, pratique et polyvalente : de légères variations dans la technique permettront de cibler différentes voies, c’est-à-dire la CST ventrale, la CST dorsale et les voies dorsales ascendantes.

Pour ce système, un virus à action locale (par exemple, AAV2) est injecté dans la région des corps cellulaires neuronaux d’intérêt. Un deuxième virus transporté rétrograde qui contrôle l’expression du virus local est injecté aux terminaisons axonales pour cette population neuronale. Ainsi, par définition, seuls les neurones corticospinaux sont étiquetés. Le virus rétroAAV-Cre a été choisi avec un promoteur de CMV constituant actif, car le plasmide navette est utilisé pour générer plusieurs sérotypes AAV pour l’expression Cre-dépendante dans plusieurs types cellulaires. Pour les injections corticales, AAV2 a été choisi avec le transgène entraîné par le promoteur de la synapsine-1 pour limiter toute expression aux neurones. Parce que le système 2-viral repose davantage sur l’origine et la terminaison de la population neuronale d’intérêt, plusieurs promoteurs différents pourraient être utilisés, s’ils peuvent conduire l’expression des gènes d’intérêt au sein de la population neuronale d’intérêt. Par exemple, le promoteur neuronal excitateur, CamKII, pourrait être substitué à la synapsine-1. En plus de l’utilisation de ces sérotypes AAV, le transport rétrograde dans les motoneurones corticospinaux immatures et, dans une bien moindre mesure, adultes peut également être réalisé à l’aide du lentivirus transportable hautement rétrograde (HiRet)²⁵. Les lentivirus HiRet utilisent une glycoprotéine chimérique rage/VSV pour cibler l’absorption au niveau de la synapse pour le transport rétrograde. Combiné à un promoteur Tet-On, ce système 2-viral supporte l’expression inductible de manière rétrograde^{dépendante 26,27}.

Les virus rétrogrades insèrent des vecteurs dans l’espace synaptique d’un neurone cible, ce qui lui permet d’être absorbé par l’axone de cette cellule et transporté vers le corps cellulaire. Alors que les vecteurs lentiviraux ont déjà connu un énorme succès, fournissant une expression à long terme dans les études de thérapie génique, cette méthode s’est tournée vers les vecteurs viraux adéno-associés pour quelques raisons simples^26,28: AAV est plus économique, tout aussi efficace et présente moins de fardeau logistique, étant donné qu’il a une désignation de niveau de biosécurité inférieure 29,30,31,32 . Alors que AAV2, le sérotype le plus utilisé, démontre une transfection robuste des axones CST, les futurs chercheurs pourraient noter que AAV1 offre une certaine polyvalence car il marque de manière transynaptique, mettant ainsi en avant plusieurs itérations possibles dans de futures études³³. L’adaptation finale consiste à coder le virus rétrograde avec la Cre-recombinase afin que plusieurs vecteurs antérogrades puissent être introduits simultanément, réduisant ainsi les déchets viraux internes inutiles et maximisant la probabilité que les DREADDs s’expriment dans la bonne orientation.

En fin de compte, ce protocole démontre l’injection simultanée dans le cortex et la colonne cervicale, ciblant spécifiquement les corps cellulaires et les terminaisons axonales du tractus corticospinal, respectivement. La transfection haute fidélité est observée dans le cortex cérébral et la moelle épinière. Bien que le protocole décrit ait été perfectionné pour les rats Sprague Dawley âgés de 5 jours, il convient aux jours postnataux 4 à 10 avec des ajustements mineurs à l’anesthésie et aux coordonnées stéréotaxiques.