Targeting des kortikospinalen Trakts bei neonatalen Ratten mit einem doppelviralen Vektor mittels kombinierter Gehirn- und Wirbelsäulenchirurgie

Während Rückenmarksverletzung in der pädiatrischen Bevölkerung relativ selten vorkommt, ist sie besonders traumatisch und verursacht eine dauerhafte Behinderung, die eine immense logistische Voraussicht erfordert. Darüber hinaus wird ein höherer Anteil pädiatrischer Rückenmarksverletzungen als zervikal und vollständig eingestuft als in der erwachsenen Bevölkerung ^1,2. Ein Kennzeichen aller Säugetierarten ist, dass sich Neugeborene deutlich besser von einer Rückenmarksverletzung erholen als erwachsene Tiere, und dies bietet die Möglichkeit, die treibenden Mechanismen für die Erholung in jüngeren Populationen zu bewerten ^3,4,5. Trotzdem gibt es weniger multimodale Studien, die sich mit der Erforschung von Neugeborenen und Säuglingsnagetieren befassen, was zum Teil auf die zusätzliche Schwierigkeit zurückzuführen ist, ausgewählte Populationen von Neuronen in den viel engeren anatomischen Orientierungspunkten jüngerer Tiere genau anzuvisieren⁶. Dieser Artikel konzentriert sich auf die direkte Injektion von hocheffizienten anterograden und retrograden Adeno-assoziierten Vektoren in das Rückenmark der Ratte, um wichtige motorische Bahnen mit der Anwendung von Cre-abhängigen DREADDs zu modulieren, wodurch die Reichweite multimodaler Regenerationsstudien erweitert wird.

Virale Vektoren sind wichtige biologische Werkzeuge mit einer breiten Palette von Anwendungen, einschließlich der Einführung von genetischem Material, um Zielgene zu ersetzen, Wachstumsproteine hochzuregulieren und die anatomische Landschaft des ZNS ^7,8,9 zu verfolgen. Viele der anatomischen Details der motorischen Bahnen der Wirbelsäule wurden mit klassischen Tracer, d.h. biotinyliertem Dextranamin, untersucht. Während traditionelle Tracer maßgeblich zur Aufdeckung der Neuroanatomie beigetragen haben, sind sie nicht ohne Nachteile: Sie markieren wahllos Signalwege, selbst wenn sie korrekt injiziert werden, und Studien haben gezeigt, dass sie von beschädigten Axonen aufgenommen werden^10,11,12. Folglich könnte dies zu falschen Interpretationen in Regenerationsstudien führen, bei denen abgetrennte Axone mit regenerierenden Fasern verwechselt werden könnten.

Die folgende Methode nutzt das Zwei-Virus-Vektorsystem, das kürzlich in Modulationsstudien populär gemacht wurde, mit zwei verschiedenen viralen Vektoren in zwei getrennten Bereichen desselben Neurons^13,14. Der erste ist ein Vektor, der die Zellkörper von Projektionsneuronen lokal infiziert. Der andere ist ein retrograder Vektor, der von den Axonendigungen der Projektionsneuronen transportiert wird (Abbildung 1). Der retrograde Vektor trägt Cre-Rekombinase, und der lokale Vektor enthält die “Cre-On”-Doppel-Flox-Sequenz, in der ein fluoreszierendes Protein (mCherry) kodiert ist. Das native Transgen, das sowohl hM3Dq als auch mCherry exprimiert, ist relativ zum Promotor invertiert und wird von zwei LoxP-Stellen flankiert (Abbildung 2). Daher wird mCherry nur in den doppelt transduzierten Projektionsneuronen exprimiert, bei denen die Cre-Rekombinase ein Rekombinationsereignis zwischen den LoxP-Stellen induziert, die Orientierung des Transgens in den entsprechenden Leserahmen umdreht und die Expression sowohl des DREADD als auch des fluoreszierenden Proteins ermöglicht. Sobald sich das virale Transgen in der richtigen Ausrichtung befindet, können die DREADDs vorübergehend eine Neuromodulation durch einen separat injizierten Liganden, d.h. Clozapin-N-Oxid, induzieren. Das Protokoll wurde entwickelt, um induzierbare Neuromodulationsforschung bei Neugeborenen zu authentifizieren, wobei DREADDS injiziert werden, um die CSTs selektiv zu modulieren. Das Zwei-Virus-System fungiert als Versicherungspolice und stellt sicher, dass jede DREADD-positive Zelle unter Fluoreszenz mit hoher Genauigkeit zurückverfolgt werden kann, um die Injektionen zu validieren.

Diese Methode hilft auch, die Lücke in der Neugeborenenforschung zu schließen. Pädiatrische Rückenmarksverletzung stellt ihre Herausforderungen dar, und Forschung, die Regeneration, Keimung oder Plastizität analysiert, sollte die Unterschiede zwischen Neugeborenen und Erwachsenen betonen 3,15,16,17. Durch die Optimierung des chirurgischen Eingriffs und die Durchführung früherer anatomischer Studien mit Nissl-Färbung wurden die Koordinaten sowohl für die kranialen als auch für die spinalen Injektionen validiert. Ziel war es, eine Methode zur doppelten Injektion in eine neugeborene Ratte mit erhöhter Genauigkeit und Überlebensfähigkeit bereitzustellen.

Für das aktuelle Modell wurde der anterograde Vektor in die Zellkörper des somatomotorischen Kortex injiziert, wobei Bregma als Referenz^18,19 verwendet wurde. In Bezug auf die Wirbelsäuleninjektionen wurde der retrograde Vektor in Laminae V-VII injiziert, wo sich die CST-Axonendigungen^{befinden 20,21}. Es gibt viele grundlegende Fragen, die zugrunde liegen, wie bestimmte Läsionsmodelle jüngere Tiere unterschiedlich beeinflussen und wie die anschließende Erholung von einem älteren Tier abweicht. Diese Studie zeigt ein robustes Mittel zur Untersuchung von Gebärmutterhalsverletzungen und der Wiederherstellbarkeit der Funktion der Vordergliedmaßen bei neonatalen Nagetieren. Im Gegensatz dazu befasste sich die Mehrzahl der bisherigen Studien mit der Fortbewegung der Erholung nach Lenden- oder Thoraxverletzungen ^5,22,23,24. Durch die Paarung des doppelviralen Vektors mit der hier beschriebenen neuartigen Injektionstechnik trägt dieses Protokoll dazu bei, bestimmte Probleme (z. B. die Überlebensfähigkeit) zu mildern, die die Untersuchung von Nagetieren bei Neugeborenen beeinträchtigen können. Diese Methode ist robust, praktisch und vielseitig: Leichte Variationen in der Technik ermöglichen es, verschiedene Bahnen anzuvisieren, d.h. ventrale CST, dorsale CST und die aufsteigenden dorsalen Pfade.

Für dieses System wird ein lokal wirkendes Virus (z.B. AAV2) in die Region der interessierenden neuronalen Zellkörper injiziert. Ein zweites retrograd transportiertes Virus, das die Expression des lokalen Virus steuert, wird an den Axon-Terminals für diese neuronale Population injiziert. Daher werden definitionsgemäß nur kortikospinale Neuronen markiert. Das retroAAV-Cre-Virus wurde mit einem konstitutiv aktiven CMV-Promotor ausgewählt, da das Shuttle-Plasmid verwendet wird, um mehrere AAV-Serotypen für die Cre-abhängige Expression in verschiedenen Zelltypen zu erzeugen. Für kortikale Injektionen wurde AAV2 mit dem Transgen gewählt, das vom Synapsin-1-Promotor angetrieben wird, um die Expression auf Neuronen zu beschränken. Da das 2-virale System mehr auf den Ursprung und die Beendigung der interessierenden neuronalen Population angewiesen ist, könnten mehrere verschiedene Promotoren verwendet werden, wenn sie die Expression der interessierenden Gene innerhalb der interessierenden neuronalen Population steuern können. Zum Beispiel könnte der exzitatorische neuronale Promotor CamKII das Synapsin-1 ersetzen. Neben der Verwendung dieser AAV-Serotypen kann auch ein retrograder Transport in unreife und in viel geringerem Maße adulte kortikospinale Motoneuronen mit dem hochretrograden transportablen Lentivirus (HiRet)²⁵ erreicht werden. HiRet-Lentiviren verwenden ein chimäres Tollwut/VSV-Glykoprotein, um die Aufnahme an der Synapse für den retrograden Transport zu steuern. In Kombination mit einem Tet-On-Promotor unterstützt dieses 2-virale System die induzierbare Expression in retrograder Abhängigkeit^26,27.

Retrograde Viren schleusen Vektoren in den synaptischen Raum eines Zielneurons ein, so dass es vom Axon dieser Zelle aufgenommen und in den Zellkörper transportiert werden kann. Während lentivirale Vektoren in der Vergangenheit enormen Erfolg hatten und eine langfristige Expression in Gentherapiestudien ermöglichten, konzentrierte sich diese Methode aus einigen einfachen Gründen auf Adeno-assoziierte virale Vektoren^26,28: AAV ist wirtschaftlicher, ähnlich effektiv und stellt einen geringeren logistischen Aufwand dar, da es eine niedrigere Biosicherheitsstufe aufweist 29,30,31,32 . Während AAV2, der am häufigsten verwendete Serotyp, eine robuste Transfektion von CST-Axonen zeigt, könnten zukünftige Forscher feststellen, dass AAV1 eine gewisse Vielseitigkeit bietet, da es transynaptisch markiert und somit mehrere mögliche Iterationen in zukünftigen Studien hervorbringt³³. Die letzte Anpassung besteht darin, das retrograde Virus mit Cre-Rekombinase zu kodieren, so dass mehrere anterograde Vektoren gleichzeitig eingeführt werden können, wodurch unnötiger interner Virusabfall reduziert und die Wahrscheinlichkeit maximiert wird, dass die DREADDs in der richtigen Ausrichtung exprimieren.

Letztendlich zeigt dieses Protokoll die gleichzeitige Injektion in den Kortex und die Halswirbelsäule, die spezifisch auf die Zellkörper bzw. die Axonendigungen des Kortikospinaltraktes abzielt. High-Fidelity-Transfektion wird in der Großhirnrinde und im Rückenmark beobachtet. Während das beschriebene Protokoll für Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 5 Tagen perfektioniert wurde, ist es für die postnatalen Tage 4-10 mit geringfügigen Anpassungen der Anästhesie und der stereotaktischen Koordinaten geeignet.