Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi

SKY, pediatrik popülasyonda nispeten nadir görülen bir olay olsa da, özellikle travmatiktir ve muazzam lojistik öngörü gerektiren kalıcı bir sakatlığa neden olur. Ayrıca, pediatrik SCI’lerin daha yüksek bir oranı, yetişkin popülasyona kıyasla servikal ve tam olarak sınıflandırılır ^1,2. Memeli türleri arasında bir ayırt edici özellik, yenidoğanların SCI’den yetişkinlerden önemli ölçüde daha iyi iyileşmesidir ve bu, genç popülasyonlarda iyileşme için itici mekanizmaları değerlendirmek için bir fırsat sunar ^3,4,5. Buna rağmen, kısmen genç hayvanların çok daha sıkı anatomik yer işaretlerinde seçilmiş nöron popülasyonlarını doğru bir şekilde hedeflemenin zorluğu nedeniyle, yenidoğan ve bebek kemirgen araştırmalarını ele alan daha az multimodal çalışma vardır⁶. Bu makalede, Cre-dependent-DREADD’lerin uygulanması ile majör motor yollarını modüle etmek için sıçan omuriliğine yüksek verimli anterograd ve retrograd adeno ilişkili vektörlerin doğrudan enjeksiyonu üzerinde durulmakta ve multimodal rejenerasyon çalışmalarının kapsamı genişletilmektedir.

Viral vektörler, hedef genlerin yerini almak, büyüme proteinlerini yukarı düzenlemek ve CNS ^7,8,9’un anatomik manzarasını izlemek için genetik materyalin tanıtılması da dahil olmak üzere geniş bir uygulama alanına sahip önemli biyolojik araçlardır. Spinal motor yolakların anatomik detaylarının birçoğu klasik izleyiciler, yani biyotinile dekstran amin kullanılarak incelenmiştir. Geleneksel izleyiciler nöroanatominin ortaya çıkarılmasında etkili olsa da, dezavantajları yoktur: doğru enjekte edilseler bile yolları ayrım gözetmeksizin etiketlerler ve çalışmalar hasarlı aksonlar tarafından alındıklarını bulmuşlardır^10,11,12. Sonuç olarak, bu, kopmuş aksonların liflerin yenilenmesiyle karıştırılabileceği rejenerasyon çalışmalarında yanlış yorumlara yol açabilir.

Aşağıdaki yöntem, modülasyon çalışmalarında son zamanlarda popüler hale gelen iki viral vektör sistemini, aynı nöronun iki ayrı alanında iki farklı viral vektör ile ^13,14’ü kullanmaktadır. Birincisi, projeksiyon nöronlarının hücre gövdelerini lokal olarak enfekte eden bir vektördür. Diğeri ise projeksiyon nöronlarının akson terminallerinden taşınan retrograd bir vektördür (Şekil 1). Retrograd vektör Cre rekombinazını taşır ve yerel vektör, bir floresan proteinin (mCherry) kodlandığı “Cre-On” çift flokslu diziyi içerir. Hem hM3Dq hem de mCherry’yi ifade eden doğal transgen, promotöre göre ters çevrilir ve iki LoxP bölgesi ile çevrilidir (Şekil 2). Bu nedenle, mCherry sadece Cre rekombinazının LoxP bölgeleri arasında bir rekombinasyon olayını indüklediği, transgenin oryantasyonunu uygun okuma çerçevesine çevirdiği ve hem DREADD hem de floresan proteininin ekspresyonuna izin verdiği çift dönüşümlü projeksiyon nöronlarında ifade edilir. Viral transgen doğru yönde olduğunda ve uygulanabilir olduğunda, DREADD’ler ayrı ayrı enjekte edilen bir ligand, yani klozapin-N-oksit yoluyla geçici olarak nöromodülasyonu indükleyebilir. Protokol, yenidoğanlarda indüklenebilir nöromodülasyon araştırmalarını doğrulamak için tasarlanmıştır, burada CST’leri seçici olarak modüle etmek için DREADDS enjekte edilir. İki viral sistem, enjeksiyonları doğrulamak için her DREADD-pozitif hücrenin floresan altında yüksek doğrulukla izlenebilir olmasını sağlayan bir sigorta poliçesi görevi görür.

Bu yöntem aynı zamanda yenidoğan araştırmalarındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur. Pediatrik SCI zorluklarını ortaya koymaktadır ve rejenerasyon, filizlenme veya plastisiteyi analiz eden araştırmalar, yenidoğanlar ve yetişkinler arasındaki farkları vurgulamalıdır 3,15,16,17. Cerrahi prosedürü optimize ederek ve Nissl boyama ile önceki anatomik çalışmalar yapılarak, hem kraniyal hem de spinal enjeksiyonların koordinatları doğrulandı. Amaç, artan sadakat ve hayatta kalma kabiliyeti ile yenidoğan bir sıçana ikili enjeksiyon için bir yöntem sağlamaktı.

Mevcut model için, anterograd vektör, referans^18,19 olarak bregma kullanılarak somatomotor korteksin hücre gövdelerine enjekte edildi. Spinal enjeksiyonlar açısından, retrograd vektör, CST akson terminallerinin^20,21 bulunduğu lamina V-VII’ye enjekte edildi. Bazı lezyon modellerinin genç hayvanları nasıl farklı şekilde etkilediğinin ve sonraki iyileşmenin yaşlı bir hayvandan nasıl ayrıldığının altında yatan birçok temel soru vardır. Bu çalışma, yenidoğan kemirgenlerinde servikal yaralanmaları ve ön ayak fonksiyonunun geri kazanılabilirliğini incelemek için sağlam bir araç olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, önceki çalışmaların çoğu, lomber veya torasik yaralanmaları takiben iyileşme lokomotifini ele almıştır 5,22,23,24. Çift viral vektörü burada açıklanan yeni enjeksiyon tekniği ile eşleştirerek, bu protokol yenidoğan kemirgen araştırmalarını rahatsız edebilecek belirli sorunları (yani hayatta kalabilirlik) hafifletmeye yardımcı olur. Bu yöntem sağlam, pratik ve çok yönlüdür: teknikteki küçük değişiklikler, farklı yolakların, yani ventral CST, dorsal CST ve yükselen dorsal yolların hedeflenmesine izin verecektir.

Bu sistem için, lokal olarak etkili bir virüs (örneğin, AAV2), ilgilenilen nöronal hücre cisimlerinin bölgesine enjekte edilir. Yerel virüsün ekspresyonunu kontrol eden ikinci bir retrograd taşınan virüs, bu nöronal popülasyon için akson terminallerine enjekte edilir. Böylece, tanım gereği, sadece kortikospinal nöronlar etiketlenir. RetroAAV-Cre virüsü, yapısal olarak aktif bir CMV promotörü ile seçildi, çünkü mekik plazmid, çeşitli hücre tiplerinde Cre’ye bağımlı ekspresyon için birkaç AAV serotipi üretmek için kullanıldı. Kortikal enjeksiyonlar için, AAV2, nöronlara herhangi bir ifadeyi sınırlamak için sinapsin-1 promotor tarafından tahrik edilen transgen ile seçildi. 2-viral sistem, ilgilenilen nöronal popülasyonun kökenine ve sona ermesine daha fazla dayandığından, ilgilenilen nöronal popülasyon içindeki ilgi genlerinin ekspresyonunu yönlendirebilirlerse, birkaç farklı destekleyiciler kullanılabilir. Örneğin, uyarıcı nöronal promotör CamKII, sinapsin-1 ile değiştirilebilir. Bu AAV serotiplerinin kullanımına ek olarak, olgunlaşmamış ve çok daha az ölçüde retrograd transport, yetişkin kortikospinal motor nöronları da yüksek retrograd taşınabilir lentivirüs (HiRet) ^{kullanılarak elde edilebilir25}. HiRet lentivirüsleri, retrograd taşıma için sinapstaki alımı hedeflemek için kimerik Kuduz / VSV glikoproteini kullanır. Bir Tet-On promotörü ile birleştirilen bu 2-viral sistem, geriye dönük bağımlı bir şekilde indüklenebilir ekspresyonu destekler^26,27.

Retrograd virüsler, bir hedef nöronun sinaptik boşluğuna vektörler yerleştirir ve bu hücrenin aksonu tarafından alınmasına ve hücre gövdesine taşınmasına izin verir. Lentiviral vektörler daha önce gen terapisi çalışmalarında uzun vadeli ekspresyon sağlayan muazzam bir başarıya sahip olsalar da, bu yöntem birkaç basit nedenden dolayı adeno ilişkili viral vektörlere yönelmiştir^26,28: AAV daha ekonomiktir, benzer şekilde etkilidir ve daha düşük bir biyogüvenlik seviyesi tanımına sahip olduğu göz önüne alındığında daha az lojistik yük sunar 29,30,31,32 . En çok kullanılan serotip olan AAV2, CST aksonlarının sağlam transfeksiyonunu gösterirken, gelecekteki araştırmacılar, AAV1’in transinaptik olarak etiketlenirken çok yönlülük sunduğunu ve böylece gelecekteki çalışmalarda birkaç olası yineleme ortaya koyduğunu not edebilir³³. Son adaptasyon, retrograd virüsü Cre-rekombinaz ile kodlamaktır, böylece birden fazla anterograd vektör aynı anda tanıtılabilir, böylece gereksiz kurum içi virüs atıklarını azaltır ve DRED’lerin doğru yönde ifade etme olasılığını en üst düzeye çıkarır.

Nihayetinde, bu protokol korteks ve servikal omurgaya eşzamanlı enjeksiyonu gösterir, özellikle sırasıyla hücre gövdelerini ve kortikospinal sistemin akson terminallerini hedef alır. Yüksek doğrulukta transfeksiyon serebral korteks ve omurilikte görülür. Tarif edilen protokol 5 günlük Sprague Dawley sıçanları için mükemmelleştirilmiş olsa da, anestezi ve stereotaktik koordinatlarda küçük ayarlamalarla doğum sonrası günler 4-10 için uygundur.