Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

Embora a LM seja uma ocorrência relativamente rara na população pediátrica, é particularmente traumática e causa uma incapacidade permanente que requer imensa previsão logística. Além disso, uma maior proporção de LME pediátrica é classificada como cervical e completa em comparação com a população adulta ^1,2. Uma característica das espécies de mamíferos é que os neonatos se recuperam notavelmente melhor da LM do que os adultos, o que oferece uma oportunidade para avaliar os mecanismos determinantes para a recuperação em populações mais jovens ^3,4,5. Apesar disso, há menos estudos multimodais que abordam a pesquisa de recém-nascidos e roedores infantis, em parte devido à dificuldade adicional de direcionar com precisão populações selecionadas de neurônios nos marcos anatômicos muito mais apertados de animais mais jovens⁶. Este artigo enfoca a injeção direta de vetores adenoassociados ânterogrados e retrógrados altamente eficientes na medula espinhal de ratos para modular as principais vias motoras com a aplicação de DREADDs dependentes de Cre, expandindo o alcance de estudos de regeneração multimodal.

Os vetores virais são importantes ferramentas biológicas com uma amplitude de aplicações, incluindo a introdução de material genético para substituir genes-alvo, regular positivamente as proteínas de crescimento e traçar a paisagem anatômica do SNC ^7,8,9. Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras espinhais têm sido estudados usando traçadores clássicos, ou seja, a amina dextrana biotinilada. Embora os traçadores tradicionais tenham sido fundamentais para a descoberta da neuroanatomia, eles não estão isentos de desvantagens: eles rotulam indiscriminadamente as vias, mesmo que corretamente injetados, e estudos descobriram que eles são absorvidos por axônios danificados^10,11,12. Consequentemente, isso poderia levar a interpretações incorretas em estudos de regeneração, onde axônios cortados poderiam ser confundidos com fibras regeneradoras.

O método a seguir utiliza o sistema de vetores bivirais recentemente popularizado em estudos de modulação, com dois vetores virais diferentes em duas áreas separadas do mesmo neurônio^13,14. O primeiro é um vetor que infecta localmente os corpos celulares dos neurônios de projeção. O outro é um vetor retrógrado sendo transportado dos terminais axônicos dos neurônios de projeção (Figura 1). O vetor retrógrado carrega Cre recombinase, e o vetor local incorpora a sequência de floxe duplo “Cre-On” na qual uma proteína fluorescente (mCherry) é codificada. O transgene nativo que expressa tanto hM3Dq quanto mCherry é invertido em relação ao promotor e é flanqueado por dois sítios LoxP (Figura 2). Assim, o mCherry só é expresso nos neurônios de projeção duplamente transduzidos onde a Cre recombinase induz um evento de recombinação entre os sítios LoxP, invertendo a orientação do transgene para o quadro de leitura apropriado e permitindo a expressão do DREADD e da proteína fluorescente. Uma vez que o transgene viral esteja na orientação correta, e quando aplicável, os DREADDs podem induzir transitoriamente a neuromodulação através de um ligante injetado separadamente, ou seja, clozapina-N-óxido. O protocolo foi projetado para autenticar pesquisas de neuromodulação induzíveis em neonatos, em que os DREADDS são injetados para modular os CSTs seletivamente. O sistema de dois vírus atua como uma apólice de seguro, garantindo que cada célula positiva para DREADD seja rastreável sob fluorescência com alta fidelidade para validar as injeções.

Este método também ajuda a preencher a lacuna na pesquisa neonatal. A LM pediátrica apresenta seus desafios, e pesquisas que analisem a regeneração, a brotação ou a plasticidade devem enfatizar as diferenças entre neonatos e adultos 3,15,16,17. Otimizando o procedimento cirúrgico e realizando estudos anatômicos prévios com coloração de Nissl, as coordenadas para as injeções cranianas e espinhais foram validadas. O objetivo era fornecer um método para injeções duplas em um rato neonatal com maior fidelidade e capacidade de sobrevivência.

Para o modelo atual, o vetor anterógrado foi injetado nos corpos celulares do córtex somatomotor utilizando o bregma como referência^18,19. Em relação às injeções espinhais, o vetor retrógrado foi injetado nas lâminas V-VII, onde residem os terminais axônicos CST^20,21. Existem muitas questões fundamentais subjacentes a como certos modelos de lesões afetam animais mais jovens de forma diferente e como a recuperação subsequente diverge de um animal mais velho. Este estudo demonstra um meio robusto de estudar lesões cervicais e a recuperabilidade da função dos membros anteriores em roedores neonatais. Em contrapartida, a maioria dos estudos anteriores abordou a locomoção da recuperação após lesões lombares ou torácicas 5,22,23,24. Ao emparelhar o vetor duplo-viral com a nova técnica de injeção descrita aqui, este protocolo ajuda a mitigar certos problemas (ou seja, a capacidade de sobrevivência) que podem atormentar as investigações de roedores neonatais. Este método é robusto, prático e versátil: pequenas variações na técnica permitirão atingir diferentes vias, ou seja, TSC ventral, TSC dorsal e vias dorsais ascendentes.

Para este sistema, um vírus de ação local (por exemplo, AAV2) é injetado na região dos corpos celulares neuronais de interesse. Um segundo vírus transportado retrógrado que controla a expressão do vírus local é injetado nos terminais axônicos para essa população neuronal. Assim, por definição, apenas os neurônios corticoespinhais são rotulados. O vírus retroAAV-Cre foi escolhido com um promotor de CMV constitutivamente ativo, pois o plasmídeo shuttle é usado para gerar vários sorotipos de AAV para expressão dependente de Cre em vários tipos de células. Para injeções corticais, o AAV2 foi escolhido com o transgene acionado pelo promotor de sinapsina-1 para limitar qualquer expressão aos neurônios. Como o sistema 2-viral depende mais da origem e término da população neuronal de interesse, vários promotores diferentes poderiam ser usados, se eles puderem impulsionar a expressão dos genes de interesse dentro da população neuronal de interesse. Por exemplo, o promotor neuronal excitatório, CamKII, poderia ser substituído pela sinapsina-1. Além do uso desses sorotipos de AAV, o transporte retrógrado para imaturos e, em muito menor grau, neurônios motores corticoespinhais adultos também pode ser alcançado usando o lentivírus transportável retrógrado alto (HiRet)²⁵. Os lentivírus HiRet usam uma glicoproteína quimérica de raiva/VSV para direcionar a captação na sinapse para o transporte retrógrado. Combinado com um promotor Tet-On, este sistema 2-viral suporta a expressão induzível de forma retrógrada-dependente^26,27.

Os vírus retrógrados inserem vetores no espaço sináptico de um neurônio-alvo, permitindo que ele seja absorvido pelo axônio dessa célula e transportado para o corpo celular. Embora os vetores lentivirais tenham tido anteriormente um tremendo sucesso, proporcionando expressão a longo prazo em estudos de terapia gênica, esse método girou em direção aos vetores virais adenoassociados por algumas razões simples^26,28: o AAV é mais econômico, igualmente eficaz e apresenta menos carga logística, uma vez que possui uma designação de nível de biossegurança mais baixa 29,30,31,32 . Enquanto o AAV2, o sorotipo mais utilizado, demonstra transfecção robusta de axônios CST, futuros pesquisadores podem notar que o AAV1 oferece alguma versatilidade ao rotular transinapticamente, apresentando assim várias iterações possíveis em estudos futuros³³. A adaptação final é codificar o vírus retrógrado com Cre-recombinase para que múltiplos vetores anterógrados possam ser introduzidos simultaneamente, reduzindo assim o desperdício desnecessário de vírus internos e maximizando a probabilidade de os DREADDs se expressarem na orientação correta.

Em última análise, este protocolo demonstra a injeção simultânea no córtex e na coluna cervical, visando especificamente os corpos celulares e os terminais axônicos do trato corticoespinhal, respectivamente. A transfecção de alta fidelidade é observada no córtex cerebral e na medula espinhal. Embora o protocolo descrito tenha sido aperfeiçoado para ratos Sprague Dawley com 5 dias de idade, é adequado para os dias pós-natais 4-10 com pequenos ajustes na anestesia e coordenadas estereotáxicas.