Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie

Hoewel dwarslaesie een relatief zeldzame gebeurtenis is in de pediatrische populatie, is het bijzonder traumatisch en veroorzaakt het een permanente handicap die een enorme logistieke vooruitziende blik vereist. Bovendien wordt een hoger percentage pediatrische GCB’s geclassificeerd als cervicaal en compleet in vergelijking met de volwassen populatie ^1,2. Een kenmerk van zoogdiersoorten is dat pasgeborenen aanzienlijk beter herstellen van dwarslaesie dan volwassenen, en dit biedt een kans om de drijvende mechanismen voor herstel bij jongere populaties te beoordelen ^3,4,5. Desondanks zijn er minder multimodale studies die onderzoek naar pasgeborenen en babyknaagdieren aanpakken, deels vanwege de extra moeilijkheid om zich nauwkeurig te richten op geselecteerde populaties neuronen in de veel strakkere anatomische oriëntatiepunten van jongere dieren⁶. Dit artikel richt zich op de directe injectie van zeer efficiënte anterograde en retrograde adeno-geassocieerde vectoren in het ruggenmerg van de rat om belangrijke motorische paden te moduleren met de toepassing van Cre-afhankelijke-DREADDs, waardoor het bereik van multimodale regeneratiestudies wordt uitgebreid.

Virale vectoren zijn belangrijke biologische hulpmiddelen met een breed scala aan toepassingen, waaronder de introductie van genetisch materiaal om doelgenen te vervangen, groei-eiwitten te upreguleren en het anatomische landschap van het CZS^te traceren ^7,8,9. Veel van de anatomische details van spinale motorische routes zijn bestudeerd met behulp van klassieke tracers, d.w.z. gebiotinyleerd dextran amine. Hoewel traditionele tracers een belangrijke rol hebben gespeeld bij het blootleggen van neuroanatomie, zijn ze niet zonder hun nadelen: ze labelen willekeurig paden, zelfs als ze correct worden geïnjecteerd, en studies hebben aangetoond dat ze worden opgenomen door beschadigde axonen 10,11,12. Bijgevolg kan dit leiden tot onjuiste interpretaties in regeneratiestudies waarbij afgehakte axonen kunnen worden aangezien voor regenererende vezels.

De volgende methode maakt gebruik van het twee-virale vectorsysteem dat onlangs populair is geworden in modulatiestudies, met twee verschillende virale vectoren in twee afzonderlijke gebieden van hetzelfde neuron^13,14. De eerste is een vector die lokaal de cellichamen van projectieneuronen infecteert. De andere is een retrograde vector die wordt getransporteerd vanuit de axonterminals van de projectielonen (figuur 1). De retrograde vector draagt Cre-recombinase en de lokale vector bevat de “Cre-On” dubbel-gefloxeerde sequentie waarin een fluorescerend eiwit (mCherry) wordt gecodeerd. Het native transgen dat zowel hM3Dq als mCherry tot expressie brengt, is omgekeerd ten opzichte van de promotor en wordt geflankeerd door twee LoxP-sites (figuur 2). mCherry komt dus alleen tot expressie in de dubbel getransduceerde projectieneuronen waar Cre-recombinase een recombinatiegebeurtenis induceert tussen de LoxP-sites, waarbij de oriëntatie van het transgen in het juiste leesframe wordt omgedraaid en de expressie van zowel het DREADD- als het fluorescerende eiwit mogelijk wordt gemaakt. Zodra het virale transgen in de juiste oriëntatie is, en indien van toepassing, kunnen de DREADDs tijdelijk neuromodulatie induceren via een afzonderlijk geïnjecteerd ligand, d.w.z. clozapine-N-oxide. Het protocol is ontworpen om induceerbaar neuromodulatieonderzoek bij pasgeborenen te verifiëren, waarbij DREADDS worden geïnjecteerd om de CST’s selectief te moduleren. Het twee-virale systeem fungeert als een verzekeringspolis en zorgt ervoor dat elke DREADD-positieve cel traceerbaar is onder fluorescentie met hoge betrouwbaarheid om de injecties te valideren.

Deze methode helpt ook om de kloof in neonataal onderzoek te overbruggen. Pediatrische dwarslaesie presenteert zijn uitdagingen, en onderzoek dat regeneratie, kiemen of plasticiteit analyseert, moet de verschillen tussen pasgeborenen en volwassenen benadrukken 3,15,16,17. Door de chirurgische ingreep te optimaliseren en eerdere anatomische studies met Nissl-kleuring uit te voeren, werden de coördinaten voor zowel de craniale als de spinale injecties gevalideerd. Het doel was om een methode te bieden voor dubbele injecties in een neonatale rat met verhoogde getrouwheid en overlevingskansen.

Voor het huidige model werd de anterograde vector geïnjecteerd in de cellichamen van de somatomotorische cortex met behulp van bregma als referentie ^18,19. In termen van de spinale injecties werd de retrograde vector geïnjecteerd in laminae V-VII, waar de CST-axonterminals ^20,21 bevinden. Er zijn veel fundamentele vragen die ten grondslag liggen aan hoe bepaalde laesiemodellen jongere dieren anders beïnvloeden en hoe het daaropvolgende herstel afwijkt van een ouder dier. Deze studie toont een robuuste manier om cervicale verwondingen en het herstelvermogen van de voorpootfunctie bij neonatale knaagdieren te bestuderen. Daarentegen hebben de meeste eerdere studies betrekking op herstel voortbeweging na lumbale of thoracale verwondingen 5,22,23,24. Door de dubbel-virale vector te koppelen aan de nieuwe injectietechniek die hier wordt beschreven, helpt dit protocol bepaalde problemen (d.w.z. overlevingskansen) te verminderen die neonatale knaagdieronderzoeken kunnen teisteren. Deze methode is robuust, praktisch en veelzijdig: kleine variaties in de techniek maken het mogelijk om verschillende paden te richten, d.w.z. ventrale CST, dorsale CST en de opgaande dorsale paden.

Voor dit systeem wordt één lokaal werkend virus (bijv. AAV2) geïnjecteerd in het gebied van de neuronale cellichamen van belang. Een tweede retrograde getransporteerd virus dat de expressie van het lokale virus regelt, wordt geïnjecteerd op de axonterminals voor die neuronale populatie. Zo worden per definitie alleen corticospinale neuronen gelabeld. Het retroAAV-Cre-virus werd gekozen met een constitutief actieve CMV-promotor omdat het shuttleplasmide wordt gebruikt om verschillende AAV-serotypen te genereren voor Cre-afhankelijke expressie in verschillende celtypen. Voor corticale injecties werd gekozen voor AAV2 met het transgen aangedreven door de synapsine-1 promotor om elke expressie tot neuronen te beperken. Omdat het 2-virale systeem meer afhankelijk is van de oorsprong en beëindiging van de neuronale populatie van belang, kunnen verschillende promotors worden gebruikt, als ze de expressie van de genen van belang binnen de neuronale populatie van belang kunnen stimuleren. De exciterende neuronale promotor, CamKII, zou bijvoorbeeld kunnen worden vervangen door de synapsine-1. Naast het gebruik van deze AAV-serotypen kunnen retrograde transport naar onvolwassen en in veel mindere mate ook volwassen corticospinale motorneuronen worden bereikt met behulp van het hoge retrograde transporteerbare lentivirus (HiRet)²⁵. HiRet lentivirussen gebruiken een chimere Rabiës / VSV glycoproteïne om opname op de synaps te richten voor retrograde transport. In combinatie met een Tet-On promotor ondersteunt dit 2-virale systeem induceerbare expressie op een retrograde-afhankelijke manier ^26,27.

Retrograde virussen brengen vectoren in de synaptische ruimte van een doelneuron, waardoor het door het axon van die cel kan worden opgenomen en naar het cellichaam kan worden getransporteerd. Hoewel lentivirale vectoren eerder enorm succes hebben gehad en langetermijnexpressie bieden in gentherapiestudies, draaide deze methode om een paar eenvoudige redenen naar adeno-geassocieerde virale vectoren^26,28: AAV is zuiniger, vergelijkbaar effectief en vormt minder logistieke last, aangezien het een lagere bioveiligheidsniveauaanduiding heeft 29,30,31,32 . Hoewel AAV2, het meest gebruikte serotype, een robuuste transfectie van CST-axonen vertoont, kunnen toekomstige onderzoekers opmerken dat AAV1 enige veelzijdigheid biedt omdat het transynaptisch labelt, waardoor verschillende mogelijke iteraties in toekomstige studies naar voren komen³³. De laatste aanpassing is om het retrograde virus te coderen met Cre-recombinase, zodat meerdere anterogradevectoren tegelijkertijd kunnen worden geïntroduceerd, waardoor onnodig intern virusafval wordt verminderd en de kans wordt gemaximaliseerd dat de DREADDs zich in de juiste oriëntatie uitdrukken.

Uiteindelijk demonstreert dit protocol gelijktijdige injectie in de cortex en cervicale wervelkolom, specifiek gericht op respectievelijk de cellichamen en de axonterminals van het corticospinale kanaal. High-fidelity transfectie wordt gezien in de hersenschors en het ruggenmerg. Hoewel het beschreven protocol werd geperfectioneerd voor Sprague Dawley-ratten van 5 dagen oud, is het geschikt voor postnatale dagen 4-10 met kleine aanpassingen aan anesthesie en stereotactische coördinaten.