Нацеливание на кортикоспинальный тракт у неонатальных крыс с двойным вирусным вектором с использованием комбинированной хирургии головного мозга и позвоночника

Хотя ТСМ является относительно редким явлением в педиатрической популяции, она особенно травматична и вызывает постоянную инвалидность, требующую огромного логистического предвидения. Кроме того, более высокая доля детских ВЦИ классифицируется как цервикальная и полная по сравнению со взрослым населением ^1,2. Отличительной чертой всех видов млекопитающих является то, что новорожденные значительно лучше восстанавливаются после ТСМ, чем взрослые, и это дает возможность оценить движущие механизмы восстановления в более молодых популяциях ^3,4,5. Несмотря на это, существует меньше мультимодальных исследований, посвященных исследованиям новорожденных и детенышей грызунов, отчасти из-за дополнительной сложности точного нацеливания на отдельные популяции нейронов в гораздо более жестких анатомических ориентирах молодых животных⁶. Эта статья посвящена прямому введению высокоэффективных антероградных и ретроградных аденоассоциированных векторов в спинной мозг крыс для модуляции основных двигательных путей с применением Cre-dependent-DREADD, расширяя охват исследований мультимодальной регенерации.

Вирусные векторы являются важными биологическими инструментами с широким спектром применений, включая введение генетического материала для замены генов-мишеней, повышения регуляции белков роста и отслеживания анатомического ландшафта ЦНС ^7,8,9. Многие анатомические детали спинномозговых путей были изучены с использованием классических индикаторов, то есть биотинилированного декстранамина. В то время как традиционные индикаторы сыграли важную роль в раскрытии нейроанатомии, они не лишены своих недостатков: они без разбора маркируют пути, даже если они правильно введены, и исследования показали, что они поглощаются поврежденными аксонами 10,11,12. Следовательно, это может привести к неправильным интерпретациям в исследованиях регенерации, где отрезанные аксоны могут быть ошибочно приняты за регенерирующие волокна.

Следующий метод использует двухвирусную векторную систему, недавно популяризированную в исследованиях модуляции, с двумя различными вирусными векторами в двух отдельных областях одного и того же нейрона^13,14. Первый представляет собой вектор, который локально заражает клеточные тела проекционных нейронов. Другой представляет собой ретроградный вектор, переносимый из аксонных терминалей проекционных нейронов (рисунок 1). Ретроградный вектор несет рекомбиназу Cre, а локальный вектор включает в себя двойную флоксированную последовательность «Cre-On», в которой кодируется флуоресцентный белок (mCherry). Нативный трансген, экспрессирующий как hM3Dq, так и mCherry, инвертирован относительно промотора и окружен двумя loxP-сайтами (рисунок 2). Таким образом, mCherry выражается только в дважды трансдуцированных проекционных нейронах, где cre-рекомбиназа индуцирует событие рекомбинации между сайтами LoxP, переворачивая ориентацию трансгена в соответствующую рамку считывания и позволяя экспрессировать как DREADD, так и флуоресцентный белок. Как только вирусный трансген находится в правильной ориентации, и когда это применимо, DREADD могут временно индуцировать нейромодуляцию через отдельно введенный лиганд, то есть клозапин-N-оксид. Протокол был разработан для аутентификации индуцируемых исследований нейромодуляции у новорожденных, в которых DREADDS вводятся для селективной модуляции ГПСП. Двухвирусная система действует как страховой полис, гарантируя, что каждая DREADD-положительная клетка отслеживается под флуоресценцией с высокой точностью для проверки инъекций.

Этот метод также помогает преодолеть разрыв в неонатальных исследованиях. Педиатрическая ТСМ представляет свои проблемы, и исследования, анализирующие регенерацию, прорастание или пластичность, должны подчеркнуть различия между новорожденными и взрослыми 3,15,16,17. Оптимизируя хирургическую процедуру и выполняя предыдущие анатомические исследования с окрашиванием Nissl, координаты как для черепных, так и для спинальных инъекций были проверены. Цель состояла в том, чтобы обеспечить метод двойных инъекций неонатальной крысе с повышенной точностью и живучестью.

Для текущей модели антероградный вектор вводили в клеточные тела соматодвигательной коры, используя брегму в качестве эталона^18,19. С точки зрения спинальных инъекций, ретроградный вектор вводили в пластинки V-VII, где терминали аксона CST находятся^20,21. Существует много фундаментальных вопросов, лежащих в основе того, как определенные модели поражения по-разному влияют на молодых животных и как последующее восстановление отличается от более старого животного. Это исследование демонстрирует надежные средства изучения травм шейки матки и восстанавливаемости функции передней конечности у новорожденных грызунов. Напротив, большинство предыдущих исследований касались восстановления локомоции после травм поясницы или грудной клетки 5,22,23,24. Сочетая двойной вирусный вектор с новой техникой инъекций, описанной здесь, этот протокол помогает смягчить определенные проблемы (например, живучесть), которые могут препятствовать исследованиям новорожденных грызунов. Этот метод является надежным, практичным и универсальным: небольшие вариации в технике позволят нацеливаться на различные пути, то есть вентральный CST, дорсальный CST и восходящие дорсальные пути.

Для этой системы один локально действующий вирус (например, AAV2) вводится в область интересующих тел нейрональных клеток. Второй ретроградно транспортируемый вирус, который контролирует экспрессию местного вируса, вводится в терминалы аксона для этой нейронной популяции. Таким образом, по определению, маркируются только кортикоспинальные нейроны. РетроAAV-Cre вирус был выбран с конститутивно активным промотором ЦМВ, поскольку челночная плазмида используется для генерации нескольких серотипов AAV для Cre-зависимой экспрессии в нескольких типах клеток. Для корковых инъекций AAV2 был выбран с трансгеном, приводимым в действие промотором синапсина-1, чтобы ограничить любую экспрессию нейронами. Поскольку 2-вирусная система больше зависит от происхождения и прекращения интересующей нейронной популяции, можно использовать несколько различных промоторов, если они могут управлять экспрессией генов, представляющих интерес в интересующей нейронной популяции. Например, возбуждающий нейрональный промотор, CamKII, может быть заменен синапсином-1. В дополнение к использованию этих серотипов AAV, ретроградный транспорт в незрелый и в гораздо меньшей степени, взрослые кортикоспинальные двигательные нейроны также могут быть достигнуты с использованием высоко ретроградного транспортабельного лентивируса (HiRet)²⁵. Лентивирусы HiRet используют химерный гликопротеин Rabies / VSV для нацеливания поглощения синапсом для ретроградного транспорта. В сочетании с промотором Tet-On эта 2-вирусная система поддерживает индуцируемую экспрессию ретроградно-зависимым образом^26,27.

Ретроградные вирусы вставляют векторы в синаптическое пространство нейрона-мишени, позволяя ему поглощаться аксоном этой клетки и транспортироваться в тело клетки. В то время как лентивирусные векторы ранее имели огромный успех, обеспечивая долгосрочную экспрессию в исследованиях генной терапии, этот метод развернулся в сторону аденоассоциированных вирусных векторов по нескольким простым причинам^26,28: AAV более экономичен, так же эффективен и представляет меньшую логистическую нагрузку, учитывая, что он имеет более низкий уровень биобезопасности 29,30,31,32 . В то время как AAV2, наиболее часто используемый серотип, демонстрирует надежную трансфекцию аксонов CST, будущие исследователи могут отметить, что AAV1 предлагает некоторую универсальность, поскольку он маркирует трансинаптически, тем самым выдвигая несколько возможных итераций в будущих исследованиях³³. Окончательная адаптация заключается в кодировании ретроградного вируса кре-рекомбиназой таким образом, чтобы несколько антероградных векторов могли быть введены одновременно, тем самым уменьшая ненужные внутренние вирусные отходы и максимизируя вероятность того, что DREADD экспрессируются в правильной ориентации.

В конечном счете, этот протокол демонстрирует одновременную инъекцию в кору и шейный отдел позвоночника, особенно нацеленную на клеточные тела и аксонные терминали кортикоспинального тракта соответственно. Высокоточная трансфекция наблюдается в коре головного мозга и спинном мозге. В то время как описанный протокол был усовершенствован для крыс Sprague Dawley 5-дневного возраста, он подходит для послеродовых дней 4-10 с незначительными корректировками анестезии и стереотаксических координат.