Summary

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Published: June 01, 2021
doi:

Summary

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。

Abstract

スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、リボソームによって翻訳されている特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用できる強力なツールです。この技術では、自動グラジエントメーカーとグラジエント分画システムが一般的に使用されますが、これらのシステムは一般的に高価であり、リソースが限られている、または研究のためにこの方法を実行する頻度が低いか時折必要ないために費用を正当化できないラボにとっては法外なコストになる可能性があります。ここでは、特殊な分画装置なしでほとんどの分子生物学研究室で利用可能な標準装置を使用して、ポリソームプロファイルを再現性よく生成するためのプロトコルが提示されています。さらに、グラジエント分画システムの有無にかかわらず生成されたポリソームプロファイルの比較が提供されます。再現性のあるポリソームプロファイルを最適化して生成するための戦略について説明します。 サッカロミセス・セレビシエ は、このプロトコルのモデル生物として利用されています。ただし、このプロトコルは、多くの異なる生物および細胞タイプのリボソームプロファイルを生成するために簡単に変更および適合させることができます。

Introduction

リボソームは、mRNAをタンパク質に翻訳する基本的なプロセスを実行するメガダルトンリボ核タンパク質複合体です。リボソームは、細胞内のすべてのタンパク質の合成を実行する役割を果たします。真核生物のリボソームは、沈降係数に応じて小さなリボソームサブユニット(40S)と大きなリボソームサブユニット(60S)として指定された2つのサブユニットで構成されています。完全に組み立てられたリボソームは80Sモノソームとして指定されます。ポリソームは、単一のmRNA分子の翻訳に従事するリボソームのグループです。スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、翻訳リボソームに関連する特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用される強力な方法です1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 13。この技術は、単一のリボソーム、リボソームサブユニット、およびメッセンジャーリボ核タンパク質粒子からポリソームを分離するためによく使用されます。分画から得られたプロファイルは、ポリソーム14の翻訳活性およびリボソーム151617の集合状態に関する貴重な情報を提供することができる。

リボソーム集合は、リボソーム集合因子18192021として知られるタンパク質群によって促進される非常に複雑なプロセスである。これらの因子は、ATPアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、GTPアーゼ、RNAヘリカーゼ、およびRNA結合タンパク質を含む他の多くのタンパク質との相互作用を通じて、リボソーム生合成中に幅広い機能を果たします22。ポリソーム分画は、リボソームアセンブリにおけるこれらの因子の役割を調査するために使用される強力なツールです。例えば、この方法は、pre-rRNAプロセシング因子であるポリヌクレオチドキナーゼGrc3の変異がリボソームアセンブリプロセスにどのように悪影響を及ぼし得るかを実証するために利用されている17,23。ポリソームプロファイリングはまた、ATPase Rix7内の保存されたモチーフがリボソーム産生にどのように不可欠であるかを強調し、示しています16

ポリソーム分画の手順は、目的の細胞から可溶性細胞ライセートを作ることから始まります。ライセートは、RNA、リボソームサブユニット、およびポリソーム、ならびに他の可溶性細胞成分を含有する。連続的な直線的なスクロース勾配は、超遠心チューブ内で行われます。細胞ライセートの可溶性画分は、スクロース勾配チューブの上部に穏やかにロードされます。次に、装填された勾配チューブを遠心分離にかけ、重力によってスクロース勾配内のサイズによって細胞成分を分離します。大きいコンポーネントは、小さいコンポーネントよりも勾配にさらに移動します。グラデーションの上部には、小さくて移動の遅い細胞成分が格納され、大きくて移動の速い細胞成分は下部にあります。遠心分離後、チューブの内容物をフラクションとして収集します。この方法は、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを効果的に分離します。次いで、各画分の光学濃度は、波長254nmにおける分光吸光度を測定することによって決定される。吸光度対分数を比較すると、ポリソームプロファイルが得られます。

線形スクロース密度勾配は、勾配メーカーを利用して生成することができる。遠心分離後、グラジエントはしばしば分画され、吸光度は自動密度分画システム37132425を用いて測定される。これらのシステムはポリソームプロファイルを生成するのに非常にうまく機能しますが、高価であり、一部のラボでは法外なコストがかかる可能性があります。ここでは、これらの機器を使用せずにポリソームプロファイルを生成するためのプロトコルが提示されています。代わりに、このプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で通常利用可能な機器を利用します。

Protocol

1. 7%〜47%スクロースグラジエントの調製 注:スクロース勾配の線形範囲は、使用する細胞の種類に応じて、より良い分離を達成するために変更できます。このプロトコルは、 S. cerevisiaeのポリソームプロファイル用に最適化されています。 スクロースグラジエントバッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl2、および1 mM DTT)で7%および47%スクロース…

Representative Results

3つの代表的なポリソームプロファイルを図3に示す。すべてのプロファイルは同じ酵母株からのものです。典型的なポリソームプロファイルは、40S、60S、および80Sリボソームサブユニットおよびポリソームのよく分解されたピークを有する。各リボソームサブユニットの頂上とポリソームピークは、各プロファイルで明らかになります(図3)。自動?…

Discussion

ここでは、高価な自動分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを作成する方法について説明しました。この方法の利点は、自動分画システムを持たないラボがポリソームプロファイリングにアクセスできることです。このプロトコルの主な欠点は、専用の密度分画システムと比較して、面倒な手の分画と感度の低下です。

このプロトコルでは、リボソームサ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、この原稿を批判的に読んでくれたパーシー・タンバレ博士とメリッサ・ウェルズ博士に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所の壁内研究プログラムによってサポートされました。米国国立環境衛生科学研究所(NIEHS;ZIA ES103247 から R.E.S.

Materials

Automatic Fractionator Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader BMG Labtech
Cycloheximide Sigma Aldrich C7698
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
Glass Beads, acid washed Sigma Aldrich G8772 425–600 μm
Heparin Sigma Aldrich H4784
Magnesium Chloride, 1 M KD Medical CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub Hamilton Company 7748-08 custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes Beckman Coulter 331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack Fisher Scientific 14-810-54A
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32855
RNAse Inhibitor Applied Biosystems N8080119
Sucrose Sigma Aldrich S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg Beckman Coulter 331336
Syringe, 3 mL Coviden 888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4 KD Medical RGF-3340
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
UV-Star Microplate, 96 wells Greiner Bio-One 655801

References

  1. Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
  2. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).
  3. Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
  4. Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
  5. Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
  6. Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
  7. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  8. Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
  9. Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).
  10. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
  11. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
  12. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
  13. Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
  14. Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
  15. Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
  16. Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
  17. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
  18. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  19. Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
  20. Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
  21. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
  22. Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
  23. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  24. Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
  25. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
  26. Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
  27. Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
  28. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Play Video

Cite This Article
Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems. J. Vis. Exp. (172), e62680, doi:10.3791/62680 (2021).

View Video