Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Os ribossomos são complexos ribonucleoproteicos mega-Dalton que realizam o processo fundamental de tradução de mRNA em proteínas. Os ribossomos são responsáveis por realizar a síntese de todas as proteínas dentro de uma célula. Os ribossomos eucarióticos compreendem duas subunidades designadas como a pequena subunidade ribossomal (40S) e a grande subunidade ribossomal (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. O ribossomo totalmente montado é designado como o monossomo dos anos 80. Os polissomos são grupos de ribossomos envolvidos na tradução de uma única molécula de mRNA. O fracionamento de polissomas por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é um método poderoso usado para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos associados à tradução de ribossomos e analisar fatores associados a polissomos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. Esta técnica é frequentemente usada para separar polissomos de ribossomos únicos, subunidades ribossomais e partículas de ribonucleoproteína mensageiras. Os perfis obtidos a partir do fracionamento podem fornecer informações valiosas sobre a atividade de tradução dos polissomos¹⁴ e o status de montagem dos ribossomos^15,16,17.

A montagem do ribossomo é um processo muito complexo facilitado por um grupo de proteínas conhecido como fatores de montagem do ribossomo ^18,19,20,21. Esses fatores desempenham uma ampla gama de funções durante a biogênese do ribossomo por meio de interações com muitas outras proteínas, incluindo ATPases, endo e exonucleases, GTPases, helicases de RNA e proteínas de ligação ao RNA²². O fracionamento de polissomos tem sido uma ferramenta poderosa usada para investigar o papel desses fatores na montagem de ribossomos. Por exemplo, esse método tem sido utilizado para demonstrar como mutações na polinucleotídeo quinase Grc3, um fator de processamento pré-rRNA, podem afetar negativamente o processo de montagem do ribossomo^17,23. O perfil de polissomas também destacou e mostrou como os motivos conservados dentro da ATPase Rix7 são essenciais para a produção de ribossomos¹⁶.

O procedimento para o fracionamento de polissomos começa com a produção de lisados celulares solúveis a partir de células de interesse. O lisado contém RNA, subunidades ribossomais e polissomos, bem como outros componentes celulares solúveis. Um gradiente de sacarose contínuo e linear é feito dentro de um tubo ultracentrífugo. A fração solúvel do lisado celular é suavemente carregada no topo do tubo de gradiente de sacarose. O tubo de gradiente carregado é então submetido à centrifugação, que separa os componentes celulares por tamanho dentro do gradiente de sacarose pela força da gravidade. Os componentes maiores viajam mais para dentro do gradiente do que os componentes menores. A parte superior do gradiente abriga os componentes celulares menores e mais lentos, enquanto os componentes celulares maiores e mais rápidos são encontrados na parte inferior. Após a centrifugação, o conteúdo do tubo é coletado como frações. Este método efetivamente separa subunidades ribossomais, monossomos e polissomos. A densidade óptica de cada fração é então determinada medindo a absorvância espectral a um comprimento de onda de 254 nm. A plotagem da absorbância vs. número de frações produz um perfil polissômico.

Gradientes lineares de densidade de sacarose podem ser gerados utilizando um fabricante de gradientes. Após a centrifugação, os gradientes são frequentemente fracionados e as absorvâncias medidas usando um sistema automatizado de fracionamento de densidade 3,7,13,24,25. Embora esses sistemas funcionem muito bem para produzir perfis de polissomos, eles são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para alguns laboratórios. Aqui é apresentado um protocolo para gerar perfis de polissomas sem o uso desses instrumentos. Em vez disso, este protocolo utiliza equipamentos normalmente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular.