Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento
Summary
Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.
Abstract
El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es una herramienta poderosa que se puede utilizar para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos que son traducidos por ribosomas y analizar factores asociados a polisomas. Si bien los fabricantes automatizados de gradientes y los sistemas de fraccionamiento de gradiente se usan comúnmente con esta técnica, estos sistemas son generalmente costosos y pueden ser prohibitivos para los laboratorios que tienen recursos limitados o no pueden justificar el gasto debido a su necesidad poco frecuente u ocasional de realizar este método para su investigación. Aquí, se presenta un protocolo para generar de forma reproducible perfiles polisomáticos utilizando equipos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular sin instrumentos especializados de fraccionamiento. Además, se proporciona una comparación de perfiles de polisomas generados con y sin un sistema de fraccionamiento de gradiente. Se discuten estrategias para optimizar y producir perfiles polisómicos reproducibles. Saccharomyces cerevisiae se utiliza como organismo modelo en este protocolo. Sin embargo, este protocolo se puede modificar y adaptar fácilmente para generar perfiles de ribosomas para muchos organismos y tipos de células diferentes.
Introduction
Los ribosomas son complejos de ribonucleoproteínas mega-Dalton que realizan el proceso fundamental de traducir el ARNm en proteínas. Los ribosomas son responsables de llevar a cabo la síntesis de todas las proteínas dentro de una célula. Los ribosomas eucariotas comprenden dos subunidades designadas como la subunidad ribosómica pequeña (40S) y la subunidad ribosómica grande (60S) de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. El ribosoma completamente ensamblado se designa como el monosoma 80S. Los polisomas son grupos de ribosomas dedicados a traducir una sola molécula de ARNm. El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es un método poderoso utilizado para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos asociados con la traducción de ribosomas y analizar factores asociados a polisomas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica se utiliza a menudo para separar polisomas de ribosomas individuales, subunidades ribosómicas y partículas de ribonucleoproteína mensajera. Los perfiles obtenidos del fraccionamiento pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad de traducción de los polisomas14 y el estado de ensamblaje de los ribosomas15,16,17.
El ensamblaje de ribosomas es un proceso muy complejo facilitado por un grupo de proteínas conocidas como factores de ensamblaje de ribosomas 18,19,20,21. Estos factores realizan una amplia gama de funciones durante la biogénesis de los ribosomas a través de interacciones con muchas otras proteínas, incluyendo ATPasas, endo y exo-nucleasas, GTPasas, helicasas de ARN y proteínas de unión a ARN22. El fraccionamiento de polisomas ha sido una poderosa herramienta utilizada para investigar el papel de estos factores en el ensamblaje de ribosomas. Por ejemplo, este método ha sido utilizado para demostrar cómo las mutaciones en la polinucleótido quinasa Grc3, un factor de procesamiento pre-rRNA, pueden afectar negativamente el proceso de ensamblaje de ribosomas17,23. El perfil de polisomas también ha resaltado y mostrado cómo los motivos conservados dentro de la ATPasa Rix7 son esenciales para la producción de ribosomas16.
El procedimiento para el fraccionamiento de polisomas comienza con la fabricación de lisados celulares solubles a partir de células de interés. El lisado contiene ARN, subunidades ribosómicas y polisomas, así como otros componentes celulares solubles. Se realiza un gradiente de sacarosa lineal continuo dentro de un tubo de ultracentrífuga. La fracción soluble del lisado celular se carga suavemente en la parte superior del tubo de gradiente de sacarosa. El tubo de gradiente cargado se somete a centrifugación, que separa los componentes celulares por tamaño dentro del gradiente de sacarosa por la fuerza de la gravedad. Los componentes más grandes viajan más lejos en el gradiente que los componentes más pequeños. La parte superior del gradiente alberga los componentes celulares más pequeños y lentos, mientras que los componentes celulares más grandes y de viaje más rápido se encuentran en la parte inferior. Después de la centrifugación, el contenido del tubo se recoge como fracciones. Este método separa eficazmente las subunidades ribosómicas, monosomas y polisomas. La densidad óptica de cada fracción se determina midiendo la absorbancia espectral a una longitud de onda de 254 nm. Trazar absorbancia vs. número de fracción produce un perfil de polisoma.
Los gradientes lineales de densidad de sacarosa se pueden generar utilizando un fabricante de gradiente. Después de la centrifugación, los gradientes a menudo se fraccionan y las absorbancias se miden utilizando un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad 3,7,13,24,25. Si bien estos sistemas funcionan muy bien para producir perfiles polisomónicos, son costosos y pueden ser prohibitivos para algunos laboratorios. Aquí se presenta un protocolo para generar perfiles polisómicos sin el uso de estos instrumentos. En cambio, este protocolo utiliza equipos típicamente disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se ha descrito un método para crear perfiles polisómicos sin el uso de costosos sistemas de fraccionamiento automatizado. La ventaja de este método es que hace que el perfil de polisomas sea accesible para los laboratorios que no tienen sistemas de fraccionamiento automatizados. Las principales desventajas de este protocolo son el tedioso fraccionamiento manual y la sensibilidad reducida en comparación con el sistema de fraccionamiento de densidad dedicado.
Este protocolo implica una…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Percy Tumbale y a la Dra. Melissa Wells por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
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