Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme
Summary
Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.
Abstract
Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomlar tarafından çevrilen spesifik mRNA’ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Otomatik gradyan üreticileri ve gradyan fraksiyonasyon sistemleri bu teknikle yaygın olarak kullanılırken, bu sistemler genellikle pahalıdır ve sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir veya araştırmaları için bu yöntemi nadiren veya ara sıra gerçekleştirme ihtiyaçları nedeniyle masrafı haklı çıkaramazlar. Burada, özel fraksiyonasyon aletleri olmadan çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanı kullanarak çoğaltılabilir polizom profilleri üretmek için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, gradyan fraksiyonasyon sistemi olan ve olmayan polizom profillerin karşılaştırılması sağlanmaktadır. Tekrarlanabilir polizom profillerini optimize etme ve üretme stratejileri tartışılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae bu protokolde model organizma olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu protokol birçok farklı organizma ve hücre tipi için ribozom profilleri oluşturmak üzere kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.
Introduction
Ribozomlar, mRNA’yı proteinlere dönüştürmenin temel işlemini gerçekleştiren mega-Dalton ribonükleoprotein kompleksleridir. Ribozomlar, bir hücre içindeki tüm proteinlerin sentezini gerçekleştirmekten sorumludur. Ökaryotik ribozomlar, sedimantasyon katsayılarına göre küçük ribozomal alt birim (40S) ve büyük ribozomal alt birim (60S) olarak adlandırılan iki alt birimden oluşur. Tamamen monte edilmiş ribozom, 80S monozomu olarak adlandırılır. Polizomlar, tek bir mRNA molekülünü çevirmekle uğraşan ribozom gruplarıdır. Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomların çevrilmesiyle ilişkili spesifik mRNA’ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Bu teknik genellikle polizomları tek ribozomlardan, ribozomal alt birimlerden ve haberci ribonükleoprotein parçacıklarından ayırmak için kullanılır. Fraksiyonasyondan elde edilen profiller, polizomların çeviri aktivitesi14 ve ribozomların montaj durumu15,16,17 hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Ribozom montajı, ribozom montaj faktörleri18,19,20,21 olarak bilinen bir grup protein tarafından kolaylaştırılan çok karmaşık bir süreçtir. Bu faktörler, ribozom biyogenezi sırasında, ATPazlar, endo ve ekzo-nükleazlar, GTPazlar, RNA helikazlar ve RNA bağlayıcı proteinler22 dahil olmak üzere diğer birçok proteinle etkileşimler yoluyla çok çeşitli işlevler yerine getirir. Polizom fraksiyonasyonu, bu faktörlerin ribozom montajındaki rolünü araştırmak için kullanılan güçlü bir araç olmuştur. Örneğin, bu yöntem, bir pre-rRNA işleme faktörü olan polinükleotid kinaz Grc3’teki mutasyonların ribozom montaj işlemini nasıl olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermek için kullanılmıştır17,23. Polizom profilleme ayrıca ATPase Rix7 içindeki korunmuş motiflerin ribozom üretimi için nasıl gerekli olduğunu vurgulamış ve göstermiştir16.
Polizom fraksiyonasyonu prosedürü, ilgilenilen hücrelerden çözünür hücre lizatları yapmakla başlar. Lisat RNA, ribozomal alt birimler ve polizomların yanı sıra diğer çözünür hücresel bileşenleri içerir. Bir ultrasantrifüj tüpü içinde sürekli, doğrusal bir sakkaroz gradyanı yapılır. Hücre lizatının çözünür fraksiyonu, sakkaroz gradyan tüpünün üstüne yavaşça yüklenir. Yüklü gradyan tüpü daha sonra santrifüjlemeye tabi tutulur, bu da hücresel bileşenleri sakkaroz gradyanı içindeki boyuta göre yerçekimi kuvveti ile ayırır. Daha büyük bileşenler, gradyana daha küçük bileşenlerden daha fazla gider. Degradenin üst kısmı daha küçük, daha yavaş hareket eden hücresel bileşenleri barındırırken, altta daha büyük, daha hızlı hareket eden hücresel bileşenler bulunur. Santrifüjlemeden sonra, tüpün içeriği fraksiyonlar halinde toplanır. Bu yöntem ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları etkili bir şekilde ayırır. Her fraksiyonun optik yoğunluğu daha sonra spektral absorbansın 254 nm dalga boyunda ölçülmesiyle belirlenir. Absorbans ve fraksiyon sayısının çizilmesi polizom profili verir.
Doğrusal sakkaroz yoğunluk gradyanları, bir gradyan oluşturucu kullanılarak üretilebilir. Santrifüjlemeyi takiben, gradyanlar genellikle fraksiyone edilir ve absorbanslar otomatik bir yoğunluk fraksiyonasyonsistemi 3,7,13,24,25 kullanılarak ölçülür. Bu sistemler polizom profilleri üretmek için çok iyi çalışsa da, pahalıdır ve bazı laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir. Burada, bu aletleri kullanmadan polizom profilleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bunun yerine, bu protokol tipik olarak çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan ekipmanı kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, pahalı otomatik fraksiyonasyon sistemleri kullanılmadan polizom profilleri oluşturmanın bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemin avantajı, polizom profillemeyi otomatik fraksiyonasyon sistemlerine sahip olmayan laboratuvarlar için erişilebilir hale getirmesidir. Bu protokolün en büyük dezavantajları, sıkıcı el fraksiyonasyonu ve özel yoğunluk fraksiyonasyon sistemine kıyasla daha az hassasiyettir.
Bu protokol, ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Dr. Percy Tumbale ve Dr. Melissa Wells’e bu makaleyi eleştirel okumaları için teşekkür eder. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247 ila R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
