Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

I ribosomi sono complessi ribonucleoproteici mega-Dalton che svolgono il processo fondamentale di traduzione dell’mRNA in proteine. I ribosomi sono responsabili della sintesi di tutte le proteine all’interno di una cellula. I ribosomi eucariotici comprendono due subunità designate come la piccola subunità ribosomiale (40S) e la grande subunità ribosomiale (60S) in base ai loro coefficienti di sedimentazione. Il ribosoma completamente assemblato è designato come monosoma 80S. I polisomi sono gruppi di ribosomi impegnati nella traduzione di una singola molecola di mRNA. Il frazionamento dei polisomi mediante la centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio è un potente metodo utilizzato per creare profili ribosomiali, identificare specifici mRNA associati alla traduzione dei ribosomi e analizzare i fattori associati ai polisomi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. Questa tecnica è spesso usata per separare i polisomi da singoli ribosomi, subunità ribosomiali e particelle ribonucleoproteiche messaggere. I profili ottenuti dal frazionamento possono fornire preziose informazioni riguardanti l’attività di traslazione dei polisomi¹⁴ e lo stato di assemblaggio dei ribosomi^15,16,17.

L’assemblaggio dei ribosomi è un processo molto complesso facilitato da un gruppo di proteine note come fattori di assemblaggio dei ribosomi 18,19,20,21. Questi fattori svolgono una vasta gamma di funzioni durante la biogenesi dei ribosomi attraverso interazioni con molte altre proteine, tra cui ATPasi, endo- ed eso-nucleasi, GTPasi, elicasi di RNA e proteine leganti l’RNA²². Il frazionamento dei polisomi è stato un potente strumento utilizzato per studiare il ruolo di questi fattori nell’assemblaggio dei ribosomi. Ad esempio, questo metodo è stato utilizzato per dimostrare come le mutazioni nella polinucleotide chinasi Grc3, un fattore di elaborazione pre-rRNA, possano influenzare negativamente il processo di assemblaggio del ribosoma^17,23. Il profilo dei polisomi ha anche evidenziato e mostrato come i motivi conservati all’interno dell’ATPasi Rix7 siano essenziali per la produzione di ribosomi¹⁶.

La procedura per il frazionamento dei polisomi inizia con la produzione di lisati cellulari solubili da cellule di interesse. Il lisato contiene RNA, subunità ribosomiali e polisomi, nonché altri componenti cellulari solubili. Un gradiente di saccarosio continuo e lineare viene realizzato all’interno di un tubo di ultracentrifuga. La frazione solubile del lisato cellulare viene caricata delicatamente sulla parte superiore del tubo gradiente di saccarosio. Il tubo gradiente caricato viene quindi sottoposto a centrifugazione, che separa i componenti cellulari per dimensione all’interno del gradiente di saccarosio dalla forza di gravità. I componenti più grandi viaggiano più nel gradiente rispetto ai componenti più piccoli. La parte superiore del gradiente ospita i componenti cellulari più piccoli e più lenti, mentre i componenti cellulari più grandi e più veloci si trovano nella parte inferiore. Dopo la centrifugazione, il contenuto del tubo viene raccolto come frazioni. Questo metodo separa efficacemente subunità ribosomiali, monosomi e polisomi. La densità ottica di ciascuna frazione viene quindi determinata misurando l’assorbanza spettrale a una lunghezza d’onda di 254 nm. Tracciando l’assorbanza rispetto al numero di frazioni si ottiene un profilo polisomico.

I gradienti lineari di densità del saccarosio possono essere generati utilizzando un generatore di gradienti. Dopo la centrifugazione, i gradienti vengono spesso frazionati e le assorbanze misurate utilizzando un sistema automatico di frazionamento della densità 3,7,13,24,25. Mentre questi sistemi funzionano molto bene per produrre profili polisomici, sono costosi e possono essere proibitivi dal punto di vista dei costi per alcuni laboratori. Qui viene presentato un protocollo per generare profili polisomici senza l’uso di questi strumenti. Invece, questo protocollo utilizza apparecchiature tipicamente disponibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare.