Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement
Summary
Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.
Abstract
Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est un outil puissant qui peut être utilisé pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques traduits par les ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes. Bien que les fabricants de gradient automatisés et les systèmes de fractionnement de gradient soient couramment utilisés avec cette technique, ces systèmes sont généralement coûteux et peuvent être prohibitifs pour les laboratoires qui ont des ressources limitées ou qui ne peuvent pas justifier la dépense en raison de leur besoin peu fréquent ou occasionnel d’effectuer cette méthode pour leurs recherches. Ici, un protocole est présenté pour générer de manière reproductible des profils de polysomes en utilisant l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire sans instruments de fractionnement spécialisés. De plus, une comparaison des profils de polysomes générés avec et sans système de fractionnement par gradient est fournie. Les stratégies visant à optimiser et à produire des profils polysomiques reproductibles sont discutées. Saccharomyces cerevisiae est utilisé comme organisme modèle dans ce protocole. Cependant, ce protocole peut être facilement modifié et adapté pour générer des profils de ribosomes pour de nombreux organismes et types de cellules différents.
Introduction
Les ribosomes sont des complexes de ribonucléoprotéines méga-Dalton qui effectuent le processus fondamental de traduction de l’ARNm en protéines. Les ribosomes sont responsables de la synthèse de toutes les protéines d’une cellule. Les ribosomes eucaryotes comprennent deux sous-unités désignées comme la petite sous-unité ribosomique (40S) et la grande sous-unité ribosomique (60S) en fonction de leurs coefficients de sédimentation. Le ribosome entièrement assemblé est désigné comme le monosome 80S. Les polysomes sont des groupes de ribosomes engagés dans la traduction d’une seule molécule d’ARNm. Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est une méthode puissante utilisée pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques associés à la traduction des ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Cette technique est souvent utilisée pour séparer les polysomes des ribosomes simples, des sous-unités ribosomales et des particules de ribonucléoprotéine messagère. Les profils obtenus par fractionnement peuvent fournir des informations précieuses concernant l’activité de traduction des polysomes14 et l’état d’assemblage des ribosomes15,16,17.
L’assemblage des ribosomes est un processus très complexe facilité par un groupe de protéines connues sous le nom de facteurs d’assemblage des ribosomes 18,19,20,21. Ces facteurs remplissent un large éventail de fonctions au cours de la biogenèse des ribosomes grâce à des interactions avec de nombreuses autres protéines, notamment les ATPases, les endonucléases et exonucléases, les GTPases, les hélicases d’ARN et les protéines de liaison à l’ARN22. Le fractionnement des polysomes a été un outil puissant utilisé pour étudier le rôle de ces facteurs dans l’assemblage des ribosomes. Par exemple, cette méthode a été utilisée pour démontrer comment des mutations dans la kinase polynucléotidique Grc3, un facteur de traitement pré-ARNr, peuvent affecter négativement le processus d’assemblage des ribosomes17,23. Le profilage des polysomes a également mis en évidence et montré comment les motifs conservés dans l’ATPase Rix7 sont essentiels à la production de ribosomes16.
La procédure de fractionnement des polysomes commence par la fabrication de lysats cellulaires solubles à partir de cellules d’intérêt. Le lysat contient de l’ARN, des sous-unités ribosomales et des polysomes, ainsi que d’autres composants cellulaires solubles. Un gradient de saccharose continu et linéaire est réalisé dans un tube à ultracentrifugation. La fraction soluble du lysat cellulaire est délicatement chargée sur le dessus du tube de gradient de saccharose. Le tube de gradient chargé est ensuite soumis à une centrifugation, qui sépare les composants cellulaires par taille dans le gradient de saccharose par la force de gravité. Les composants les plus grands se déplacent plus loin dans le gradient que les composants plus petits. Le haut du gradient abrite les composants cellulaires plus petits et plus lents, tandis que les composants cellulaires plus grands et plus rapides se trouvent en bas. Après centrifugation, le contenu du tube est recueilli sous forme de fractions. Cette méthode sépare efficacement les sous-unités ribosomiques, les monosomes et les polysomes. La densité optique de chaque fraction est ensuite déterminée en mesurant l’absorbance spectrale à une longueur d’onde de 254 nm. Le tracé de l’absorbance par rapport au nombre de fractions donne un profil polysomique.
Des gradients linéaires de densité de saccharose peuvent être générés à l’aide d’un générateur de gradient. Après centrifugation, les gradients sont souvent fractionnés et les absorbances mesurées à l’aide d’un système automatisé de fractionnement de densité 3,7,13,24,25. Bien que ces systèmes fonctionnent très bien pour produire des profils de polysomes, ils sont coûteux et peuvent être prohibitifs pour certains laboratoires. Ici, un protocole pour générer des profils polysomiques sans l’utilisation de ces instruments est présenté. Au lieu de cela, ce protocole utilise l’équipement généralement disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une méthode pour créer des profils polysomiques sans utiliser de systèmes de fractionnement automatisés coûteux a été décrite. L’avantage de cette méthode est qu’elle rend le profilage des polysomes accessible aux laboratoires qui ne disposent pas de systèmes de fractionnement automatisés. Les principaux inconvénients de ce protocole sont le fractionnement manuel fastidieux et la sensibilité réduite par rapport au système de fractionnement de densité dédié.
Ce protoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Percy Tumbale et la Dre Melissa Wells pour leur lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Intramural Research Program des États-Unis; Institut national des sciences de la santé environnementale des États-Unis (NIEHS; ZIA ES103247 à R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
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