Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen
Summary
Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.
Abstract
Der endosomale Transport ist ein essentieller zellulärer Prozess, der eine breite Palette biologischer Ereignisse reguliert. Proteine werden aus der Plasmamembran internalisiert und dann zu den frühen Endosomen transportiert. Die internalisierten Proteine könnten zum Abbau in das Lysosom überführt oder zur Plasmamembran zurückgeführt werden. Ein robuster endozytärer Recyclingweg ist erforderlich, um die Entfernung von Membranmaterialien aus der Endozytose auszugleichen. Es wird berichtet, dass verschiedene Proteine den Signalweg regulieren, einschließlich ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6). Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist eine klassische Methode zur Zellfraktionierung. Nach der Zentrifugation werden Organellen an ihrer isopyknen Oberfläche sedimentiert. Die Fraktionen werden gesammelt und für andere nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Gewinnung einer Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die isolierten Fraktionen wurden zur Analyse ihres Proteingehalts einem Standard-Western-Blotting unterzogen. Durch die Anwendung dieser Methode identifizierten wir, dass die Plasmamembran, die auf Engulfment und Zellmotilität 1 (ELMO1), einen Ras-verwandten C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1) Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, abzielt, durch ARF6-vermitteltes endozytäres Recycling erfolgt.
Introduction
Der endosomale Transport ist ein essentieller physiologischer Prozess, der verschiedene biologische Ereignisse1impliziert, z. B. den Transport von Signalrezeptoren, Ionenkanälen und Adhäsionsmolekülen. Proteine, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, werden durch Endozytoseinternalisiert 2. Die internalisierten Proteine werden dann nach dem frühen Endosom3sortiert. Einige der Proteine zielen auf Lysosomen zum Abbau ab4. Eine beträchtliche Menge an Proteinen wird jedoch durch schnelles Recycling und langsame Recyclingprozesse wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt. Beim schnellen Recycling verlassen Proteine die frühen Endosomen und kehren direkt zur Plasmamembran zurück. Umgekehrt werden beim langsamen Recycling Proteine zunächst in das endozytäre Recyclingkompartiment sortiert und dann zurück zur Plasmamembran transportiert. Verschiedene Frachtproteine, zum Beispiel Clathrin, Retromerkomplex, Retrieverkomplex und Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein sowie SCAR Homologue (WASH) -Komplex, nehmen an solchen Membranrecyclingprozessenteil 4,5,6,7,8,9. Das Gleichgewicht der Endozytose und des Recyclingereignisses ist entscheidend für das Überleben der Zelle und trägt zu verschiedenen zellulären Ereignissen10bei, z. B. Zelladhäsion, Zellmigration, Zellpolarität und Signaltransduktion.
ARF6, eine kleine GTPase, ist ein berichteter Regulator des endozytären Transports7,11,12. Interessant ist, dass verschiedene Forschungsgruppen die Bedeutung von ARF6 für das endozytäre Recycling13,14,15,16,17aufgezeigthaben. Die Studie zielt darauf ab, den Zusammenhang zwischen ARF6-vermitteltem Neuritenauswuchs und endozytärem Recycling zu untersuchen. Der vorherige Bericht legt nahe, dass die Aktivierung von ARF6 der Rac1-Aktivität vorgelagert ist, indem sie auf den ELMO1-Dedikator des Zytokinese-1-Komplexes (DOCK180)18einwirkt. Wie ARF6 jedoch die ELMO1-DOCK180-vermittelte Rac1-Signalisierung auslöst, bleibt unklar. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurde eingesetzt, um die Rolle des ARF6-vermittelten endozytären Recyclings in einem solchen Prozess zu untersuchen. Auf diese Weise wurde die Recycling-Endosomen-haltige Fraktion aus Zelllysaten19erhalten. Die Fraktion wurde für die Proteingehaltsanalyse einem Western Blotting unterzogen. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass unter Der Anwesenheit von FE65, einem mit dem Gehirn angereicherten Adapterprotein, aktives ARF6 den Gehalt an ELMO1 in der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion erheblich erhöhte. Das folgende Protokoll enthält die Verfahren für (1) die Transfektionierung von Säugetierzellen; (2) Vorbereitung der Proben und Dichtegradientensäulen; und (3) Gewinnung der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus kultivierten Zellen durch Ultrazentrifugation. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde durch die neueste Veröffentlichung22nachgewiesen, die beweist, dass Recycling-Endosomen erfolgreich aus anderen Organellen (Abbildung 1) wie dem Golgi-Apparat und den Mitochondrien isoliert werden. Einige kritische Schritte müssen beachtet werden, um ein gutes Trennergebnis zu erzielen. Bei d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, des CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt. Die Zahlen in dieser Arbeit wurden aus unserer früheren Publikation “ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1” übernommen, die im Oktober 2020 im FASEB Journal veröffentlicht wurde.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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