Summary

Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.

Abstract

Le trafic endosomal est un processus cellulaire essentiel qui régule un large éventail d’événements biologiques. Les protéines sont internalisées à partir de la membrane plasmique, puis transportées vers les premiers endosomes. Les protéines internalisées pourraient être transitées vers le lysosome pour être dégradées ou recyclées vers la membrane plasmique. Une voie de recyclage endocytaire robuste est nécessaire pour équilibrer l’élimination des matériaux membranaires de l’endocytose. Diverses protéines régulent la voie, y compris le facteur ADP-ribosylation 6 (ARF6). L’ultracentrifugation par gradient de densité est une méthode classique de fractionnement cellulaire. Après la centrifugation, les organites sont sédimentés à leur surface isopycnique. Les fractions sont collectées et utilisées pour d’autres applications en aval. Décrit ici est un protocole pour obtenir une fraction contenant des endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité. Les fractions isolées ont été soumises à un transfert Western standard pour analyser leur teneur en protéines. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que le ciblage de la membrane plasmique de l’engloutissement et de la motilité cellulaire 1 (ELMO1), un facteur d’échange de nucléotides de guanine substrat 1 de la toxine botulique C3 (Rac1) lié à Ras, se fait par recyclage endocytaire médié par ARF6.

Introduction

Le trafic endosomal est un processus physiologique essentiel qui implique divers événements biologiques1,par exemple, le transport des récepteurs de signalisation, des canaux ioniques et des molécules d’adhésion. Les protéines localisées au niveau de la membrane plasmique sont internalisées par endocytose2. Les protéines internalisées sont ensuite triées par l’endosomeprécoce 3. Certaines des protéines sont ciblées sur les lysosomes pour la dégradation4. Cependant, une quantité importante de protéines est recyclée à la surface de la cellule par des processus de recyclage rapides et lents. Lors d’un recyclage rapide, les protéines quittent les premiers endosomes et retournent directement à la membrane plasmique. Inversement, en cas de recyclage lent, les protéines sont d’abord triées dans le compartiment de recyclage endocytaire, puis transportées vers la membrane plasmique. Diverses protéines de cargaison, par exemple la clathrine, le complexe rétromère, le complexe retriever et la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich, et le complexe SCAR Homologue (WASH), participent à de tels processus de recyclage membranaire4,5,6,7,8,9. L’équilibre de l’endocytose et de l’événement de recyclage est crucial pour la survie cellulaire et contribue à divers événements cellulaires10, par exemple, l’adhésion cellulaire, la migration cellulaire, la polarité cellulaire et la transduction du signal.

ARF6, une petite GTPase, est un régulateur signalé du trafic endocytaire7,11,12. Fait intéressant, divers groupes de recherche ont illustré l’importance de l’ARF6 dans le recyclage endocytaire13,14,15,16,17. L’étude vise à étudier la relation entre l’excroissance de neurites médiée par ARF6 et le recyclage endocytaire. Le rapport précédent suggère que l’activation d’ARF6 se fait en amont de l’activité rac1 en agissant sur ELMO1-dédicace du complexe de cytocinèse 1 (DOCK180)18. Cependant, la façon dont ARF6 déclenche la signalisation Rac1 médiée par ELMO1-DOCK180 reste incertaine. L’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour étudier le rôle du recyclage endocytaire médié par ARF6 dans un tel processus. En utilisant cela, la fraction contenant des endosomes de recyclage a été obtenue à partir de lysats cellulaires19. La fraction a été soumise à un transfert western pour l’analyse de la teneur en protéines. Les résultats de l’immunoblot ont révélé que sous la présence de FE65, une protéine adaptatrice enrichie en cerveau, l’ARF6 actif augmentait considérablement le niveau d’ELMO1 dans la fraction contenant des endosomes de recyclage. Le protocole suivant comprend les procédures pour (1) transfecter les cellules de mammifères; 2° la préparation des échantillons et des colonnes de gradient de densité; et (3) l’obtention de la fraction contenant des endosomes de recyclage.

Protocol

1. Culture et transfection de cellules de mammifères Plaque 2 x 106 cellules dans un plat de culture de 100 mm. Utilisez quatre plats pour chaque transfection.REMARQUE : Le nombre de cellules requises peut varier selon les lignées cellulaires. L’optimisation peut être nécessaire avant de passer à l’étape d’isolement. Le lendemain, transfectez les cellules avec de la lipofectamine selon les instructions du fabricant. 2. Récolte cellulaire …

Representative Results

Après avoir fractionné les cellules HEK293 non transfectées par ultracentrifugation du gradient de densité, 12 fractions ont été collectées à partir du haut du gradient. Les fractions récoltées ont été diluées avec le tampon de dilution dans un rapport de 1:1 et soumises à une deuxième série de centrifugation. Les échantillons ont ensuite été soumis à un transfert Western pour analyser leur teneur en protéines. Comme le montre la figure 1,le marqueur d’endosomes de rec…

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit les procédures d’isolement des endosomes de recyclage des cellules cultivées par ultracentrifugation. La fiabilité de cette méthode a été démontrée par la dernière publication22, prouvant que les endosomes de recyclage sont isolés avec succès d’autres organites(Figure 1),tels que l’appareil de Golgi et les mitochondries. Certaines étapes critiques doivent être prises en compte pour obtenir un bon résultat de séparati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du programme de subventions directes CUHK, du fonds de dotation United College et du TUYF Charitable Trust. Les chiffres de ce travail ont été adaptés de notre publication précédente, « ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentialiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1 » publié dans le FASEB Journal en octobre 2020.

Materials

1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm Beckman Coulter 347287
100 mm tissue culture dish SPL 20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm Beckman Coulter C14277
5x Sample Buffer GenScript MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4850S Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide Sigma-Aldrich C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL DWK Life Sciences 357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose HyClone SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7) Santa Cruz Biotechnology SC-271519 Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
FE65 antibody (E-20) Santa Cruz Biotechnology SC-19751 Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade HyClone SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) Ambion AM4300 Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software Bio-Rad Measurement of band intensity
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody Sigma G6160 Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb Cell Signaling Technology 2276S Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Calbiochem 4010-OP
Optima L-100 XP Beckman Coulter 392050
Optima MAX-TL Beckman Coulter A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media Gibco 31985070
PBS Tablets Gibco 18912014
PhosSTOP Roche 4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody Proteintech 20229-1-AP Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose Affymetrix AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062

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Cite This Article
Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (172), e62621, doi:10.3791/62621 (2021).

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