Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero
Summary
Questo documento mira a presentare un protocollo per la preparazione del riciclaggio di endosomi da cellule di mammifero utilizzando l’ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio.
Abstract
Il traffico endosomiale è un processo cellulare essenziale che regola una vasta gamma di eventi biologici. Le proteine vengono internalizzate dalla membrana plasmatica e quindi trasportate ai primi endosomi. Le proteine internalizzate potrebbero essere transitate al lisosoma per la degradazione o riciclate nella membrana plasmatica. È necessario un robusto percorso di riciclaggio endocitico per bilanciare la rimozione dei materiali di membrana dall’endocitosi. Varie proteine sono segnalate per regolare la via, tra cui ADP-ribosilazione fattore 6 (ARF6). L’ultracentrifugazione del gradiente di densità è un metodo classico per il frazionamento cellulare. Dopo la centrifugazione, gli organelli vengono sedimentati sulla loro superficie isopicnica. Le frazioni vengono raccolte e utilizzate per altre applicazioni a valle. Qui è descritto un protocollo per ottenere una frazione contenente endosomi riciclata da cellule di mammifero trasfettate utilizzando l’ultracentrifugazione del gradiente di densità. Le frazioni isolate sono state sottoposte a western blotting standard per analizzare il loro contenuto proteico. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato che il targeting della membrana plasmatica dell’inghiottimento e della motilità cellulare 1 (ELMO1), un substrato di scambio nucleotidico della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1), avviene attraverso il riciclaggio endocitico mediato da ARF6.
Introduction
Il traffico endosomiale è un processo fisiologico essenziale che coinvolge vari eventi biologici1, ad esempio il trasporto di recettori di segnalazione, canali ionici e molecole di adesione. Le proteine localizzate nella membrana plasmatica sono internalizzate dall’endocitosi2. Le proteine internalizzate vengono quindi selezionate dall’endosoma precoce3. Alcune delle proteine sono mirate ai lisosomi per la degradazione4. Tuttavia, una quantità significativa di proteine viene riciclata sulla superficie cellulare mediante un rapido riciclaggio e processi di riciclaggio lenti. Nel riciclaggio veloce, le proteine lasciano gli endosomi precoci e ritornano direttamente alla membrana plasmatica. Al contrario, nel riciclaggio lento, le proteine vengono prima selezionate nel compartimento di riciclaggio endocitico e quindi trasportate di nuovo alla membrana plasmatica. Varie proteine di carico, ad esempio clatrina, complesso retromero, complesso retriever e proteina della sindrome di Wiskott-Aldrich e complesso SCAR Homologue (WASH), partecipano a tali processi di riciclaggio della membrana4,5,6,7,8,9. L’equilibrio dell’endocitosi e dell’evento di riciclaggio è cruciale per la sopravvivenza cellulare e contribuisce a vari eventi cellulari10, ad esempio, adesione cellulare, migrazione cellulare, polarità cellulare e trasduzione del segnale.
ARF6, una piccola GTPasi, è un regolatore segnalato del traffico endocitico7,11,12. Di interesse, vari gruppi di ricerca hanno illustrato l’importanza dell’ARF6 nel riciclo endocitico13,14,15,16,17. Lo studio mira a studiare la relazione tra la crescita dei neuriti mediata da ARF6 e il riciclaggio endocitico. Il rapporto precedente suggerisce che l’attivazione di ARF6 è a monte dell’attività di Rac1 attraverso l’azione su ELMO1-dedicatore del complesso di citochinesi 1 (DOCK180)18. Tuttavia, il modo in cui ARF6 attiva la segnalazione Rac1 mediata da ELMO1-DOCK180 rimane poco chiaro. L’ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata impiegata per studiare il ruolo del riciclaggio endocitico mediato da ARF6 in tale processo. Usando questo, la frazione contenente endosoma di riciclaggio è stata ottenuta da lisati cellulari19. La frazione è stata sottoposta a Western blotting per l’analisi del contenuto proteico. I risultati dell’immunoblot hanno rivelato che sotto la presenza di FE65, una proteina adattatrice arricchita dal cervello, L’ARF6 attivo ha aumentato sostanzialmente il livello di ELMO1 nella frazione contenente endosoma riciclato. Il seguente protocollo include le procedure per (1) trasfettare le cellule di mammifero; (2) preparazione dei campioni e delle colonne del gradiente di densità; e (3) ottenere la frazione contenente endosomi di riciclaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra delinea le procedure per isolare gli endosomi di riciclaggio dalle cellule coltivate mediante ultracentrifugazione. L’affidabilità di questo metodo è stata dimostrata dall’ultima pubblicazione22, dimostrando che gli endosomi di riciclaggio sono isolati con successo da altri organelli (Figura 1), come l’apparato di Golgi e i mitocondri. Alcuni passaggi critici devono essere prestati attenzione per ottenere un buon risultato di separazione. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council di Hong Kong, del programma di sovvenzioni dirette CUHK, del fondo di dotazione United College e del TUYF Charitable Trust. Le cifre di questo lavoro sono state adattate dalla nostra precedente pubblicazione, “ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1” pubblicata sul FASEB Journal nell’ottobre 2020.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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