Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos
Summary
Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo para la preparación de endosomas de reciclaje de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.
Abstract
El tráfico endosomal es un proceso celular esencial que regula una amplia gama de eventos biológicos. Las proteínas se internalizan desde la membrana plasmática y luego se transportan a los endosomas tempranos. Las proteínas internalizadas podrían ser transitadas al lisosoma para su degradación o recicladas de vuelta a la membrana plasmática. Se requiere una vía de reciclaje endocítica robusta para equilibrar la eliminación de materiales de membrana de la endocitosis. Se informa que varias proteínas regulan la vía, incluido el factor de ribosilación ADP 6 (ARF6). La ultracentrifugación por gradiente de densidad es un método clásico para el fraccionamiento celular. Después de la centrifugación, los orgánulos se sedimentan en su superficie isopícnica. Las fracciones se recogen y se utilizan para otras aplicaciones posteriores. Aquí se describe un protocolo para obtener una fracción de reciclaje que contiene endosomas de células de mamíferos transfectadas utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad. Las fracciones aisladas fueron sometidas a Western blotting estándar para analizar su contenido proteico. Al emplear este método, identificamos que la orientación de la membrana plasmática de la envoltura y la motilidad celular 1 (ELMO1), un sustrato de toxina botulínica C3 relacionada con Ras 1 (Rac1) factor de intercambio de nucleótidos de guanina, es a través del reciclaje endocítico mediado por ARF6.
Introduction
El tráfico endosomal es un proceso fisiológico esencial que implica diversos eventos biológicos1,por ejemplo, el transporte de receptores de señalización, canales iónicos y moléculas de adhesión. Las proteínas localizadas en la membrana plasmática se internalizan porendocitosis 2. Las proteínas internalizadas se clasifican por el endosoma temprano3. Algunas de las proteínas están dirigidas a los lisosomas para su degradación4. Sin embargo, una cantidad significativa de proteínas se reciclan de vuelta a la superficie celular mediante procesos de reciclaje rápido y reciclaje lento. En el reciclaje rápido, las proteínas abandonan los endosomas tempranos y regresan directamente a la membrana plasmática. Por el contrario, en el reciclaje lento, las proteínas se clasifican primero al compartimiento de reciclaje endocítico y luego se transportan de regreso a la membrana plasmática. Varias proteínas de carga, por ejemplo, clatrina, complejo de retrómeros, complejo retriever y proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich, y complejo SCAR Homologue (WASH), participan en tales procesos de reciclaje demembranas 4,5,6,7,8,9. El equilibrio del evento de endocitosis y reciclaje es crucial para la supervivencia celular y contribuye a varios eventos celulares10,por ejemplo, la adhesión celular, la migración celular, la polaridad celular y la transducción de señales.
ARF6, una pequeña GTPasa, es un regulador reportado del tráfico endocítico7,11,12. De interés, diversos grupos de investigación han ilustrado la importancia de ARF6 en el reciclaje endocítico13,14,15,16,17. El estudio tiene como objetivo investigar la relación entre el crecimiento de neuritas mediado por ARF6 y el reciclaje endocítico. El informe anterior sugiere que la activación de ARF6 es aguas arriba de la actividad de Rac1 al actuar sobre ELMO1-dedicador del complejo citocinesis 1 (DOCK180)18. Sin embargo, la forma en que ARF6 desencadena la señalización Rac1 mediada por ELMO1-DOCK180 sigue sin estar clara. Se empleó la ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el papel del reciclaje endocítico mediado por ARF6 en dicho proceso. Mediante el uso de esto, la fracción que contiene endosoma de reciclaje se obtuvo a partir de lisados celulares19. La fracción fue sometida a Western blotting para el análisis del contenido de proteínas. Los resultados de immunoblot revelaron que bajo la presencia de FE65, una proteína adaptadora enriquecida con cerebro, ARF6 activo aumentó sustancialmente el nivel de ELMO1 en la fracción que contiene endosomas de reciclaje. El siguiente protocolo incluye los procedimientos para (1) transfectar células de mamíferos; (2) preparación de las muestras y columnas de gradiente de densidad; y (3) la obtención de la fracción que contiene endosoma de reciclaje.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anterior describe los procedimientos para aislar el reciclaje de endosomas de células cultivadas por ultracentrifugación. La fiabilidad de este método ha sido demostrada por la última publicación22,demostrando que el reciclaje de endosomas se aísla con éxito de otros orgánulos(Figura 1),como el aparato de Golgi y las mitocondrias. Se debe prestar atención a algunos pasos críticos para obtener un buen resultado de separación. Al preparar las sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong, el esquema de subvenciones directas de CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust. Las figuras de este trabajo fueron adaptadas de nuestra publicación anterior, “ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1” publicado en faseb Journal en octubre de 2020.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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