Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen
Summary
Dit artikel heeft tot doel een protocol te presenteren voor het bereiden van recycling-endosomen uit zoogdiercellen met behulp van sucrose-dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.
Abstract
Endosomale handel is een essentieel cellulair proces dat een breed scala aan biologische gebeurtenissen reguleert. Eiwitten worden geïnternaliseerd uit het plasmamembraan en vervolgens getransporteerd naar de vroege endosomen. De geïnternaliseerde eiwitten kunnen worden overgebracht naar het lysosoom voor afbraak of worden gerecycled naar het plasmamembraan. Een robuuste endocytische recyclingroute is nodig om de verwijdering van membraanmaterialen van endocytose in evenwicht te brengen. Van verschillende eiwitten wordt gemeld dat ze de route reguleren, waaronder ADP-ribosylatiefactor 6 (ARF6). Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie is een klassieke methode voor celfractionering. Na de centrifugatie worden organellen aan hun isopreienoppervlak gesedimenteerd. De fracties worden verzameld en gebruikt voor andere downstream toepassingen. Hier wordt een protocol beschreven om een recycling endosoombevattende fractie te verkrijgen uit getransfecteerde zoogdiercellen met behulp van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De geïsoleerde fracties werden onderworpen aan standaard Western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Door deze methode te gebruiken, identificeerden we dat de plasmamembraantargeting van engulfment en celmotiliteit 1 (ELMO1), een Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1) guanine nucleotide-uitwisselingsfactor, door ARF6-gemedieerde endocytische recycling is.
Introduction
Endosomale handel is een essentieel fysiologisch proces dat verschillende biologische gebeurtenissenimpliceert 1, bijvoorbeeld het transport van signaalreceptoren, ionkanalen en adhesiemoleculen. Eiwitten gelokaliseerd bij het plasmamembraan worden geïnternaliseerd door endocytose2. De geïnternaliseerde eiwitten worden vervolgens gesorteerd op het vroege endosoom3. Sommige eiwitten zijn gericht op lysosomen voor afbraak4. Een aanzienlijke hoeveelheid eiwitten wordt echter teruggevoerd naar het celoppervlak door snelle recycling en langzame recyclingprocessen. Bij snelle recycling verlaten eiwitten de vroege endosomen en keren ze direct terug naar het plasmamembraan. Omgekeerd worden eiwitten bij langzame recycling eerst gesorteerd naar het endocytische recyclingcompartiment en vervolgens teruggevoerd naar het plasmamembraan. Verschillende ladingeiwitten, bijvoorbeeld clathrin, retromeercomplex, retrievercomplex en Wiskott-Aldrich-syndroomeiwit en SCAR Homologue (WASH) -complex, nemen deel aan dergelijke membraanrecyclingprocessen4,5,6,7,8,9. De balans van de endocytose en recyclinggebeurtenis is cruciaal voor celoverleving en draagt bij aan verschillende cellulaire gebeurtenissen10, bijvoorbeeld celadhesie, celmigratie, celpolariteit en signaaltransductie.
ARF6, een kleine GTPase, is een gerapporteerde regulator van endocytische handel7,11,12. Van belang, verschillende onderzoeksgroepen hebben het belang van ARF6 in endocytische recycling13,14,15,16,17geïllustreerd. De studie heeft tot doel de relatie tussen ARF6-gemedieerde neurietuitgroei en endocytische recycling te onderzoeken. Het vorige rapport suggereert dat de activering van ARF6 stroomopwaarts is naar Rac1-activiteit door in te werken op ELMO1-dedicator van cytokinese 1 (DOCK180) complex18. Hoe ARF6 ELMO1-DOCK180 gemedieerde Rac1-signalering activeert, blijft echter onduidelijk. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie werd gebruikt om de rol van ARF6-gemedieerde endocytische recycling in een dergelijk proces te onderzoeken. Door dat te gebruiken, werd de recycling endosoomhoudende fractie verkregen uit cellysaten19. De fractie werd onderworpen aan Western blotting voor analyse van het eiwitgehalte. De immunoblotresultaten toonden aan dat onder de aanwezigheid van FE65, een met de hersenen verrijkt adaptoreiwit, actieve ARF6 het niveau van ELMO1 in de recycling endosoombevattende fractie aanzienlijk verhoogde. Het volgende protocol omvat de procedures voor (1) transfectie van zoogdiercellen; (2) het voorbereiden van de monsters en de kolommen met dichtheidsgradiënt; en (3) het verkrijgen van de recyclingdosome-bevattende fractie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bovenstaande protocol schetst de procedures voor het isoleren van recycling-endosomen uit gekweekte cellen door ultracentrifugatie. De betrouwbaarheid van deze methode is aangetoond door de laatste publicatie22, waaruit blijkt dat recycling-endosomen met succes worden geïsoleerd uit andere organellen (figuur 1), zoals het Golgi-apparaat en mitochondriën. Er moet aandacht worden besteed aan enkele kritische stappen voor het verkrijgen van een goed scheidingsresul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Research Grants Council Hong Kong, CUHK direct grant scheme, United College endowment fund en de TUYF Charitable Trust. De cijfers in dit werk zijn aangepast van onze vorige publicatie, “ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1” gepubliceerd in het FASEB Journal in oktober 2020.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome – sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O’Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D’Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D’Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).
