Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas
Summary
Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.
Abstract
O tráfico endossomal é um processo celular essencial que regula uma ampla gama de eventos biológicos. As proteínas são internalizadas da membrana plasmática e depois transportadas para os endossómos iniciais. As proteínas internalizadas podem ser transitadas para o lysosome para degradação ou recicladas de volta à membrana plasmática. Uma via robusta de reciclagem endócítica é necessária para equilibrar a remoção de materiais de membrana da endocitose. Várias proteínas são relatadas para regular a via, incluindo o fator de ribossiation ADP 6 (ARF6). A ultracentrifugação gradiente de densidade é um método clássico para fracionamento celular. Após a centrifugação, organelas são sedimentadas em sua superfície isopécnica. As frações são coletadas e usadas para outras aplicações a jusante. Descrito aqui é um protocolo para obter uma fração contendo endosome de células de mamíferos transfectadas usando ultracentrifugação de gradiente de densidade. As frações isoladas foram submetidas à mancha ocidental padrão para analisar seu conteúdo proteico. Ao utilizar este método, identificamos que o direcionamento da membrana plasmática do engolfamento e da motilidade celular 1 (ELMO1), um substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras 1 (Rac1) fator de troca de nucleotídeos de guanina, é através da reciclagem endocítica mediada por ARF6.
Introduction
O tráfico endossomal é um processo fisiológico essencial que implica vários eventos biológicos1, por exemplo, o transporte de receptores de sinalização, canais de íons e moléculas de adesão. Proteínas localizadas na membrana plasmática são internalizadas por endocitose2. As proteínas internalizadas são então classificadas pelo endosommaprecoce 3. Algumas das proteínas são direcionadas para lisesomos para degradação4. No entanto, uma quantidade significativa de proteínas são recicladas de volta à superfície celular por processos de reciclagem rápidos e lentas. Na reciclagem rápida, as proteínas deixam os endossos precoces e retornam diretamente à membrana plasmática. Por outro lado, na reciclagem lenta, as proteínas são primeiramente classificadas ao compartimento de reciclagem endóctico e depois transportadas de volta para a membrana plasmática. Várias proteínas de carga, por exemplo, clathrin, complexo retromer, complexo de recuperador e proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich, e complexo SCAR Homologue (WASH), participam desses processos de reciclagem demembranas 4,5,6,7,8,9. O equilíbrio do evento de endocitose e reciclagem é crucial para a sobrevivência celular e contribui para diversos eventos celulares10, por exemplo, adesão celular, migração celular, polaridade celular e transdução de sinais.
ARF6, um pequeno GTPase, é um regulador relatado de tráfico endocítico7,11,12. De interesse, diversos grupos de pesquisa ilustraram a importância da ARF6 na reciclagem endocítica13,14,15,16,17. O estudo tem como objetivo investigar a relação entre o crescimento de neurite mediado pela ARF6 e a reciclagem endócítica. O relatório anterior sugere que a ativação do ARF6 é upstream para a atividade Rac1 através da atuação no complexo18(DOCK180) do ELMO1 . No entanto, ainda não está claro como o ARF6 aciona a sinalização rac1 mediada do ELMO1-DOCK180. A ultracentrifugação de gradiente de densidade foi empregada para investigar o papel da reciclagem endocítica mediada por ARF6 nesse processo. Com isso, a fração contendo endosome de reciclagem foi obtida a partir de lises celulares19. A fração foi submetida à mancha ocidental para análise de teor de proteínas. Os resultados do imunoblot revelaram que sob a presença de FE65, uma proteína adaptadora enriquecida pelo cérebro, a ARF6 ativa aumentou substancialmente o nível de ELMO1 na fração contendo endosome de reciclagem. O protocolo a seguir inclui os procedimentos para (1) transfecção de células mamíferas; (2) elaboração das amostras e colunas gradientes de densidade; e (3) obtenção da fração contendo endosome de reciclagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descreve os procedimentos para isolar a reciclagem de endossóis de células cultivadas por ultracentrifugação. A confiabilidade desse método foi demonstrada pela últimapublicação 22, comprovando que os endosários de reciclagem são isolados com sucesso de outras organelas (Figura 1),como o aparelho golgi e mitocôndrias. Alguns passos críticos precisam ser atentos para obter um bom resultado de separação. Ao preparar as soluções de sacar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos do Research Grants Council Hong Kong, cuhk direct grant scheme, United College endowment fund, e tuyf Charitable Trust. Os números deste trabalho foram adaptados de nossa publicação anterior, “ARF6-Rac1- a propagação de neurite mediada por sinalização é potencializado pelo adaptador neuronal FE65 através da orquestração ARF6 e ELMO1” publicada no FASEB Journal em outubro de 2020.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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