Summary

Analisi a livello di genoma della distribuzione delle modificazioni isoniche utilizzando il metodo di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in Magnaporthe oryzae

Published: June 02, 2021
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.

Abstract

Il sequenziamento dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) è una tecnica molecolare potente e ampiamente utilizzata per mappare le posizioni dell’intero genoma dei fattori di trascrizione (TF), dei regolatori della cromatina e delle modifiche istoniche, nonché per rilevare interi genomi per scoprire i modelli di legame TF e le modifiche post-traduzionali degli istoni. Le attività di modifica della cromatina, come la metilazione degli istoni, sono spesso reclutate in specifiche sequenze regolatorie geniche, causando cambiamenti localizzati nelle strutture della cromatina e con conseguenti effetti trascrizionali specifici. L’esplosione di riso è una malattia fungina devastante sul riso in tutto il mondo ed è un sistema modello per studiare l’interazione fungo-pianta. Tuttavia, i meccanismi molecolari nel modo in cui le modificazioni istoniche regolano i loro geni di virulenza in Magnaporthe oryzae rimangono sfuggenti. Più ricercatori devono utilizzare ChIP-seq per studiare come la modificazione epigenetica degli istoni regola i loro geni bersaglio. ChIP-seq è anche ampiamente usato per studiare l’interazione tra proteine e DNA negli animali e nelle piante, ma è meno utilizzato nel campo della patologia vegetale e non è stato ben sviluppato. In questo articolo, descriviamo il processo sperimentale e il metodo operativo di ChIP-seq per identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3) che si lega ai geni bersaglio funzionali in M. oryzae. Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.

Introduction

L’epigenetica è una branca della ricerca genetica che si riferisce al cambiamento ereditario dell’espressione genica senza modificare la sequenza nucleotidica dei geni. Un numero crescente di studi ha dimostrato che la regolazione epigenetica svolge un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo delle cellule eucariotiche, compresa la cromatina che regola e influenza l’espressione genica attraverso il processo dinamico di ripiegamento e assemblaggio in strutture di ordine superiore1,2. Il rimodellamento della cromatina e la modificazione degli istoni covalenti influenzano e regolano la funzione e la struttura della cromatina attraverso la variazione dei polimeri di cromatina, ottenendo così la funzione di regolazione dell’espressionegenica 3,4,5,6. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni includono acetilazione, fosforilazione, metilazione, monoubiquitinazione, sumoilazione e ribosilazione ADP7,8,9. La metilazione dell’istone H3K4, in particolare la trimetilazione, è stata mappata nei siti di inizio della trascrizione in cui è associata alla replicazione della trascrizione, alla ricombinazione, alla riparazione e all’elaborazione dell’RNA negli eucarioti10,11.

La tecnologia ChIP-seq è stata introdotta nel 2007 ed è diventata lo standard sperimentale per l’analisi genome-wide della regolazione trascrizionale e dei meccanismi epigenetici12,13. Questo metodo è adatto a livello di genoma e per ottenere informazioni sull’interazione tra istoni o fattori di trascrizione, compresi i segmenti di DNA delle proteine leganti il DNA. Qualsiasi sequenza di DNA reticolata a proteine di interesse coprecipita come parte del complesso della cromatina. Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione vengono utilizzate anche per sequenziare 36-100 bp di DNA, che vengono poi abbinati al genoma bersaglio corrispondente.

Nei funghi fitopatogeni, la ricerca ha recentemente iniziato a studiare come le modificazioni della metilazione degli istoni regolano i loro geni bersaglio nel processo di patogenicità. Alcuni studi precedenti hanno dimostrato che la regolazione dei geni correlati all’istone metilasi si riflette principalmente nel silenziamento genico e nella catalizzazione della produzione di metaboliti secondari (SM). MoSet1 è la metilasi H3K4 in M. oryzae. Il knockout di questo gene provoca la delezione completa della modifica H3K4me314. Rispetto al ceppo wild-type, l’espressione del gene MoCEL7C nel mutante è inibita nello stato indotto da CMC e nello stato non indotto (glucosio o cellobiosio), l’espressione di MoCEL7C è aumentatadi 15. In Fusarium graminearum,KMT6 può catalizzare la modificazione della metilazione di H3K27me3, regolare il normale sviluppo dei funghi e aiutare a regolare il “genoma criptico” contenente il cluster di geni SM16,17,18,19. Nel 2013, Connolly ha riferito che la metilazione H3K9 e H3K27 regola il processo patogeno dei funghi attraverso metaboliti secondari e fattori effettori che regolano l’inibizione dei geni bersaglio20. In Aspergillus, la modifica degli istoni H3K4me2 e H3K4me3 è correlata all’attivazione genica e svolge un ruolo importante nel controllo della regolazione del livello di cromatina dei cluster genici SM21. In M. oryzae, Tig1 (omologo a Tig1 in lieviti e mammiferi) è un HADC (istone deacetilasi)22. Il knockout del gene Tig1 porta alla completa perdita di patogenicità e capacità di produzione di spore nel mutante nullo. È più sensibile a un ambiente perossigeno, che non può produrre ifeinfettive 22.

L’esplosione di riso causata da M. oryzae. è una delle più gravi malattie del riso nella maggior parte delle aree di coltivazione del riso nel mondo19. A causa del suo processo di infezione rappresentativo, M. oryzae è simile al processo di infezione di molti importanti funghi patogeni. Poiché può facilmente eseguire operazioni di genetica molecolare, il fungo è diventato un organismo modello per lo studio delle interazioni fungo-pianta23. Il blocco di ogni fase del processo di infezione di M. oryzae può causare un’infezione non riuscita. I cambiamenti morfologici durante il processo di infezione sono strettamente regolati dall’intera funzione del genoma e dalla trascrizione genica. Tra questi, le modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni svolgono un ruolo essenziale nella regolazione trascrizionale dei geni funzionali24,25. Tuttavia, finora, sono stati condotti pochi studi sul meccanismo molecolare delle modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni e l’acetilazione degli istoni nella trascrizione dei geni della patogenesi in M. oryzae. Pertanto, l’ulteriore sviluppo del meccanismo di regolazione epigenetica del fungo blasto del riso durante la ricerca sulla rete di regolazione a monte ea valle di questi geni patogeni aiuterà a sviluppare strategie di prevenzione e controllo dell’esplosione del riso.

Con lo sviluppo della genomica funzionale come ChIP-seq, specialmente in epigenetica, questo metodo di acquisizione dati ad alto rendimento ha accelerato la ricerca sui cromosomi. Utilizzando la tecnologia sperimentale ChIP-seq, è possibile identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae e altri funghi filamentosi. Pertanto, questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base del modo in cui le modificazioni epigenetiche regolano i loro geni bersaglio candidati durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale.

Protocol

1. Preparazione di protoplasti da M. oryzae Preparare l’agar farina d’avena-pomodoro (OTA). Pesare 30-50 g di farina d’avena e farlo bollire in 800 ml di acqua (ddH2O) per 20 minuti. Filtrare attraverso due strati di garza e prendere il filtrato. Raccogli i pomodori maturi e sbucciali. Spremere il succo e filtrare attraverso due strati di garza per raccogliere 150 ml di succo filtrato. Mescolare accuratamente tutto il succo di pomodoro e il filtrato d’avena prep…

Representative Results

L’intero diagramma di flusso del metodo ChIP-seq è mostrato nella Figura 1. Gli esperimenti ChIP-seq sono stati eseguiti utilizzando anticorpi contro H3K4me3 nel ceppo wild-type P131 e tre ceppi mutanti nulli privi di gene mobre2, mospp1e moswd2 per verificare l’intero profilo genome-wide della distribuzione dell’istone H3K4me3 in M. oryzae. I protoplasti del ceppo wild-type, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2, sono stati preparati e …

Discussion

Recentemente, ChIP-seq è diventato un metodo di analisi genomica ampiamente utilizzato per determinare i siti di legame di TF o siti di arricchimento modificati da istoni specifici. Rispetto alla precedente tecnologia ChIP-seq, la nuova tecnologia ChIP-seq è altamente sensibile e flessibile. I risultati sono forniti in alta risoluzione senza effetti negativi, come il segnale di rumore causato dall’ibridazione non specifica degli acidi nucleici. Sebbene si tratta di un’analisi comune dell’espressione genica, molti metod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), dallo Special Scientific Research Project della Beijing Agriculture University (YQ201603), dal Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM201610020005), dal progetto di coltivazione di ricerca scientifica di alto livello di BUA (GJB2021005).

Materials

acidic casein hydrolysate WAKO 65072-00-6 Medium configuration
agar powder scientan 9002-18-0 Medium configuration
deoxycholic acid MedChemExpress 83-44-3 protein and dissolution
DNA End-Repair kit NovoBiotec ER81050 Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads Invitrogen no.100.02D Binding target
EB buffer JIMEI JC2174 Membrane and liquid
EDTA ThermoFisher AM9912 protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate Sigma 91079-40-2 Medium configuration
glucose Sigma 50-99-7 Medium configuration
glycogen ThermoFisher AM9510 Precipitant action
H3K4me3 antibodies Abcam ab8580 Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer illumina illumina Hiseq 2000 Large configuration
Illumina PCR primers illumina CleanPlex Random universal primer
isoamyl alcohol chemical book 30899-19-5 Purified DNA
LiCl ThermoFisher AM9480 specific removal RNA
lysing enzymes Sigma L1412-10G cell lysis buffer
Mouse IgG Yeasen 36111ES10 Animal normal immunoglobulin
NaCl solution ThermoFisher 7647-14-5 Medium configuration
NaHCO3 Seebio SH30173.08* preparation of protein complex eluent
NP-40 ThermoFisher 85124 cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit Qiagen 28004 The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors ThermoFisher A32965 A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K ThermoFisher AM2546 DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0 ThermoFisher Q33226 Medium configuration
RIPA buffer ThermoFisher 9806S cell lysis buffer
RNase A ThermoFisher AM2271 Purified DNA
SDS ThermoFisher AM9820 cover up the charge differences
sodium acetate solution ThermoFisher R1181 Acetic acid buffer
sodium deoxycholate ThermoFisher 89904 inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase ThermoFisher EL0011 Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer ThermoFisher B69 DNA ligase buffer
Tris-HCl ThermoFisher 1185-53-1 buffer action
Triton X-100 ThermoFisher HFH10 keep the membrane protein stable
yeast extract OXOID LP0021 Medium configuration

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  4. Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
  5. Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
  6. Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
  7. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
  8. Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
  9. Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
  10. Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
  11. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  12. Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
  13. Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
  14. Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
  15. Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
  16. Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
  17. Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
  18. Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
  19. Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
  20. Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
  21. Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
  22. Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
  23. Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
  24. Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
  25. Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
  26. Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).

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Cite This Article
Wu, Z., Sun, W., Zhou, S., Zhang, L., Zhao, X., Xu, Y., Wang, W. Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae. J. Vis. Exp. (172), e62423, doi:10.3791/62423 (2021).

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