تحليل على نطاق الجينوم لتوزيع تعديلات الهستون باستخدام طريقة تسلسل المناعة الكروماتين في ماغنابورتي أوريزاي
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل التوزيع على نطاق الجينوم لتعديلات الهستون، والتي يمكن أن تحدد الجينات المستهدفة الجديدة في مسببات الأمراض من M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية.
Abstract
تسلسل كروماتين المناعي (ChIP-seq) هو تقنية جزيئية قوية وتستخدم على نطاق واسع لرسم خرائط مواقع الجينوم الكاملة لعوامل النسخ (TFs) ومنظمي الكروماتين وتعديلات الهستون ، بالإضافة إلى الكشف عن الجينوم بأكمله للكشف عن أنماط ربط TF والتعديلات اللاحقة للترانسان. وغالبا ما يتم توظيف أنشطة تعديل الكروماتين، مثل ميثيل الهستون، في تسلسلات تنظيمية جينية محددة، مما يسبب تغييرات موضعية في هياكل الكروماتين ويؤدي إلى آثار نسخ محددة. انفجار الأرز هو مرض فطري مدمر على الأرز في جميع أنحاء العالم وهو نظام نموذجي لدراسة التفاعل بين الفطريات والنبات. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية في كيفية تنظيم تعديلات الهستون جيناتها الفوعة في Magnaporthe oryzae لا تزال بعيدة المنال. يحتاج المزيد من الباحثين إلى استخدام ChIP-seq لدراسة كيفية تنظيم تعديل الهستون اللاجيني لجيناتهم المستهدفة. يستخدم ChIP-seq أيضا على نطاق واسع لدراسة التفاعل بين البروتين والحمض النووي في الحيوانات والنباتات ، ولكنه أقل استخداما في مجال علم الأمراض النباتية ولم يتم تطويره بشكل جيد. في هذه الورقة، نقوم بوصف العملية التجريبية وطريقة التشغيل ل ChIP-seq لتحديد التوزيع على نطاق الجينوم لمثيلة الهستون (مثل H3K4me3) الذي يرتبط بالجينات المستهدفة الوظيفية في M. oryzae. هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل التوزيع على نطاق الجينوم لتعديلات الهستون، والتي يمكن أن تحدد الجينات المستهدفة الجديدة في مسببات الأمراض من M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية.
Introduction
علم الوراثة اللاجينية هو فرع من البحوث الجينية التي تشير إلى التغيير الوراثي للتعبير الجيني دون تغيير تسلسل النيوكليوتيدات من الجينات. وقد أظهرت عدد متزايد من الدراسات أن التنظيم اللاجيني يلعب دورا هاما في نمو وتطور الخلايا eukaryotic، بما في ذلك الكروماتين الذي ينظم ويؤثر على التعبير الجيني من خلال العملية الديناميكية للطي والتجمع في هياكل أعلىترتيبا 1،2. الكروماتين إعادة عرض وتعديل الهستون التكافؤ تؤثر وتنظم وظيفة وهيكل الكروماتين من خلال الاختلاف من البوليمرات الكروماتين، وبالتالي تحقيق وظيفة تنظيم التعبير الجيني3،4،5،6. وتشمل التعديلات ما بعد النقل من الهستون أستيل، الفوسفور، الميثيل، أحادية الوجود، السومويل، وDP ريبوسيليشن7،8،9. وقد تم تعيين ميثيل H3K4 الهستون، وخاصة تريميثيليشن، إلى مواقع بدء النسخ حيث يرتبط مع النسخ المتماثل، وإعادة التركيب، وإصلاح، وتجهيز الحمض النووي الريبي في eukaryotes10،11.
تم تقديم تقنية ChIP-seq في عام 2007 وأصبحت المعيار التجريبي للتحليل على نطاق الجينوم للتنظيم النسخي والآليات اللاجينية12و13. هذه الطريقة مناسبة على نطاق الجينوم وللحصول على معلومات التفاعل بين الهستون أو معامل النسخ، بما في ذلك شرائح الحمض النووي من بروتينات الحمض النووي الملزمة. أي تسلسل الحمض النووي مترابطة إلى البروتينات ذات الفائدة سوف coprecipitate كجزء من مجمع الكروماتين. وتستخدم تقنيات تسلسل الجيل الجديد أيضا لتسلسل 36-100 نقطة أساس من الحمض النووي، والتي يتم مطابقتها بعد ذلك مع الجينوم المستهدف المقابل.
في الفطريات النباتية ، بدأت الأبحاث مؤخرا في دراسة كيفية تنظيم تعديلات ميثيل الهستون جيناتها المستهدفة في عملية الإمراض. أثبتت بعض الدراسات السابقة أن تنظيم الجينات المرتبطة ميثيلاز الهستون ينعكس أساسا في إسكات الجينات وتحفيز إنتاج الأيض الثانوي (SM). MoSet1 هو ميثيلاز H3K4 في م. أوريزا. خروج المغلوب من هذا الجين النتائج في الحذف الكامل للتعديل H3K4me314. بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع, التعبير عن MoCEL7C الجينات في متحولة هو تثبيط في الحالة الناجمة عن CMC وفي حالة غير المستحثة (الجلوكوز أو cellobiose), التعبير عن MoCEL7C زيادة 15. في Fusarium graminearum، KMT6 يمكن أن تحفز تعديل الميثيل من H3K27me3 ، وتنظيم التطور الطبيعي للفطريات ، وتساعد على تنظيم “الجينوم خفي” التي تحتوي على مجموعة الجينات SM16،17،18،19. في عام 2013، أفاد كونولي أن الميثيل H3K9 و H3K27 ينظم العملية المسببة للأمراض من الفطريات من خلال الأيض الثانوي والعوامل المؤثرة التي تنظم تثبيط الجينات المستهدفة20. في أسبيرجيلوس، يرتبط تعديل الهستونات H3K4me2 و H3K4me3 بتنشيط الجينات ويلعب دورا هاما في التحكم في تنظيم مستوى الكروماتين لمجموعات الجينات SM21. في M. oryzae، Tig1 (متجانسة لTig1 في الخميرة والثدييات) هو HADC (الهستون deacetylase)22. خروج المغلوب من الجين Tig1 يؤدي إلى فقدان كامل للتسبب في المرض والقدرة على إنتاج بوغ في متحولة فارغة. هو أكثر حساسية لبيئة البيروكسيجين، والتي لا يمكن أن تنتج الهيفا المعدية22.
انفجار الأرز الناجم عن م. أوريزا هو واحد من أخطر أمراض الأرز في معظم مناطق زراعة الأرز في العالم19. نظرا لعملية العدوى التمثيلية ، يشبه M. oryzae عملية العدوى للعديد من الفطريات المسببة للأمراض الهامة. كما أنها يمكن أن تنفذ بسهولة العمليات الوراثية الجزيئية، أصبح الفطريات كائن حي نموذجي لدراسة التفاعلات الفطرية والنباتية23. قد يؤدي منع كل خطوة من عملية العدوى من M. oryzae في عدوى غير ناجحة. يتم تنظيم التغيرات المورفولوجية أثناء عملية العدوى بشكل صارم من خلال وظيفة الجينوم بأكملها ونسخ الجينات. من بينها ، تلعب التعديلات اللاجينية مثل ميثيل الهستون دورا أساسيا في التنظيم النسخي للجينات الوظيفية24،25. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم إجراء سوى القليل من الدراسات على الآلية الجزيئية للتعديلات اللاجينية مثل ميثيل الهستون واستيل الهستون في نسخ جينات الإمراض في M. oryzae. ولذلك، فإن مواصلة تطوير آلية التنظيم اللاجينية لفطريات انفجار الأرز أثناء البحث في الشبكة التنظيمية في المنبع والمصب لهذه الجينات المسببة للأمراض ستساعد على تطوير استراتيجيات الوقاية من انفجار الأرز ومكافحته.
مع تطور علم الجينوم الوظيفي مثل ChIP-seq ، وخاصة في علم الوراثة اللاجينية ، أدت طريقة اكتساب البيانات عالية الإنتاجية هذه إلى تسريع الأبحاث على الكروموسومات. وباستخدام التكنولوجيا التجريبية ChIP-seq، يمكن تحديد التوزيع على نطاق الجينوم لمثيلة الهستون (مثل H3K4me3، H3K27me3، H3K9me3) في M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية. لذلك ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء كيفية تنظيم التعديلات اللاجينية للجينات المستهدفة المرشحة أثناء الإمراض الفطري في علم الأمراض النباتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي الآونة الأخيرة، أصبح ChIP-seq طريقة تحليل جينومية تستخدم على نطاق واسع لتحديد المواقع الملزمة لصناديق الاستثمار التقليدية أو مواقع التخصيب المعدلة بواسطة هستونات محددة. بالمقارنة مع التكنولوجيا السابقة ChIP-seq، تكنولوجيا ChIP-seq الجديدة حساسة للغاية ومرنة. وتقدم النتائج بدقة عالية دون آثار …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31871638)، ومشروع البحث العلمي الخاص لجامعة بكين الزراعية (YQ201603)، والمشروع العلمي للجنة التعليم في بكين (KM201610020005)، ومشروع زراعة البحوث العلمية رفيع المستوى التابع ل BUA (GJB2021005).
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
