Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.
Le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) est une technique moléculaire puissante et largement utilisée pour cartographier les emplacements du génome entier des facteurs de transcription (TF), des régulateurs de chromatine et des modifications des histones, ainsi que pour détecter des génomes entiers pour découvrir des modèles de liaison TF et des modifications post-traductionnelles des histones. Les activités modifiant la chromatine, telles que la méthylation des histones, sont souvent recrutées dans des séquences de régulation géniques spécifiques, provoquant des changements localisés dans les structures de la chromatine et entraînant des effets transcriptionnels spécifiques. L’explosion de riz est une maladie fongique dévastatrice sur le riz dans le monde entier et est un système modèle pour l’étude de l’interaction champignon-plante. Cependant, les mécanismes moléculaires dans la façon dont les modifications des histones régulent leurs gènes de virulence dans Magnaporthe oryzae restent insaisissables. Plus de chercheurs doivent utiliser ChIP-seq pour étudier comment la modification épigénétique des histones régule leurs gènes cibles. ChIP-seq est également largement utilisé pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN chez les animaux et les plantes, mais il est moins utilisé dans le domaine de la pathologie végétale et n’a pas été bien développé. Dans cet article, nous décrivons le processus expérimental et la méthode de fonctionnement de ChIP-seq pour identifier la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (comme H3K4me3) qui se lie aux gènes cibles fonctionnels de M. oryzae. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.
L’épigénétique est une branche de la recherche génétique qui fait référence au changement héréditaire de l’expression des gènes sans modifier la séquence nucléotidique des gènes. Un nombre croissant d’études ont montré que la régulation épigénétique joue un rôle important dans la croissance et le développement des cellules eucaryotes, y compris la chromatine qui régule et affecte l’expression des gènes par le processus dynamique de repliement et d’assemblage dans des structures d’ordre supérieur1,2. Le remodelage de la chromatine et la modification covalente des histones affectent et régulent la fonction et la structure de la chromatine par la variation des polymères de chromatine, atteignant ainsi la fonction de régulation del’expressiondes gènes3,4,5,6. Les modifications post-traductionnelles de l’histone comprennent l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation, la monoubiquitination, la sumoylation et la ribosylation ADP7,8,9. La méthylation de l’histone H3K4, en particulier la triméthylation, a été mappée aux sites de départ de la transcription où elle est associée à la réplication de la transcription, à la recombinaison, à la réparation et au traitement de l’ARN chez les eucaryotes10,11.
La technologie ChIP-seq a été introduite en 2007 et est devenue la norme expérimentale pour l’analyse à l’échelle du génome de la régulation transcriptionnelle et des mécanismes épigénétiques12,13. Cette méthode convient à l’échelle du génome et permet d’obtenir des informations sur l’interaction des histones ou des facteurs de transcription, y compris des segments d’ADN de protéines de liaison à l’ADN. Toute séquence d’ADN réticulée à des protéines d’intérêt coprécipitera dans le cadre du complexe chromatine. Des techniques de séquençage de nouvelle génération sont également utilisées pour séquencer 36 à 100 bp d’ADN, qui sont ensuite appariés au génome cible correspondant.
Chez les champignons phytopathogènes, la recherche a récemment commencé à étudier comment les modifications de la méthylation des histones régulent leurs gènes cibles dans le processus de pathogénicité. Certaines études antérieures ont prouvé que la régulation des gènes liés à l’histone méthylase se reflète principalement dans le silençage génique et la catalyse de la production de métabolites secondaires (SM). MoSet1 est la méthylase H3K4 dans M. oryzae. L’élimination de ce gène entraîne la délétion complète de la modification H3K4me314. Par rapport à la souche de type sauvage, l’expression du gène MoCEL7C dans le mutant est inhibée à l’état induit par le CMC et à l’état non induit (glucose ou cellobiose), l’expression du MoCEL7C augmentéede 15. Dans Fusarium graminearum,KMT6 peut catalyser la modification de la méthylation de H3K27me3, réguler le développement normal des champignons et aider à réguler le « génome cryptique » contenant le groupe de gènes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly a rapporté que la méthylation H3K9 et H3K27 régule le processus pathogène des champignons par le biais de métabolites secondaires et de facteurs effecteurs qui régulent l’inhibition des gènes cibles20. Chez Aspergillus,la modification des histones H3K4me2 et H3K4me3 est liée à l’activation des gènes et joue un rôle important dans le contrôle de la régulation du niveau de chromatine des groupes de gènes SM21. Chez M. oryzae,Tig1 (homologue à Tig1 chez les levures et les mammifères) est un HADC (histone désacétylase)22. L’élimination du gène Tig1 entraîne la perte complète de la pathogénicité et de la capacité de production de spores chez le mutant nul. Il est plus sensible à un environnement peroxygénique, qui ne peut pas produire d’hyphes infectieux22.
L’explosion de riz causée par M. oryzae. est l’une des maladies du riz les plus graves dans la plupart des régions rizicoles du monde19. En raison de son processus d’infection représentatif, M. oryzae est similaire au processus d’infection de nombreux champignons pathogènes importants. Comme il peut facilement effectuer des opérations de génétique moléculaire, le champignon est devenu un organisme modèle pour l’étude des interactions fongiques-végétales23. Le blocage de chaque étape du processus d’infection de M. oryzae peut entraîner une infection infructueuse. Les changements morphologiques au cours du processus d’infection sont strictement régulés par l’ensemble de la fonction du génome et la transcription des gènes. Parmi eux, les modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones jouent un rôle essentiel dans la régulation transcriptionnelle des gènes fonctionnels24,25. Cependant, jusqu’à présent, peu d’études ont été réalisées sur le mécanisme moléculaire des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et l’acétylation des histones dans la transcription des gènes de pathogenèse chez M. oryzae. Par conséquent, le développement du mécanisme de régulation épigénétique du champignon de l’explosion du riz tout en recherchant le réseau de régulation en amont et en aval de ces gènes pathogènes aidera à développer des stratégies de prévention et de contrôle de l’explosion du riz.
Avec le développement de la génomique fonctionnelle telle que ChIP-seq, en particulier en épigénétique, cette méthode d’acquisition de données à haut débit a accéléré la recherche sur les chromosomes. En utilisant la technologie expérimentale ChIP-seq, la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (telles que H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) chez M. oryzae et d’autres champignons filamenteux peut être identifiée. Par conséquent, cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la façon dont les modifications épigénétiques régulent leurs gènes cibles candidats au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale.
Récemment, ChIP-seq est devenu une méthode d’analyse génomique largement utilisée pour déterminer les sites de liaison des TF ou des sites d’enrichissement modifiés par des histones spécifiques. Par rapport à la technologie ChIP-seq précédente, la nouvelle technologie ChIP-seq est très sensible et flexible. Les résultats sont fournis en haute résolution sans effets négatifs, tels que le signal de bruit causé par l’hybridation non spécifique des acides nucléiques. Bien qu’il s’agit d’une analy…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31871638), le projet spécial de recherche scientifique de l’Université d’agriculture de Beijing (YQ201603), le projet scientifique du Comité éducatif de Beijing (KM201610020005), le projet de culture de recherche scientifique de haut niveau de BUA (GJB2021005).
acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |