כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
רצף immunoprecipitation Chromatin (ChIP-seq) היא טכניקה מולקולרית רבת עוצמה ונפוצה למיפוי מיקומי גנום שלמים של גורמי שעתוק (TFs), מווסתי כרומטין ושינויי היסטון, כמו גם זיהוי גנומים שלמים לחשיפת דפוסי כריכה TF ושינויים פוסט-טרנסלציה של histone. פעילויות לשינוי כרומטין, כגון מתילציה histone, מגויסים לעתים קרובות רצפים רגולטוריים גנים ספציפיים, גרימת שינויים מקומיים מבני כרומטין וכתוצאה מכך אפקטים שעתוק ספציפיים. פיצוץ האורז הוא מחלה פטרייתית הרסנית על אורז ברחבי העולם והוא מערכת מודל לחקר אינטראקציה פטרייה-צמח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים באופן שבו השינויים histone לווסת הגנים virulence שלהם Magnaporthe oryzae להישאר חמקמק. חוקרים נוספים צריכים להשתמש ChIP-seq כדי לחקור כיצד שינוי אפיגנטי histone מווסת את הגנים היעד שלהם. ChIP-seq נמצא גם בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון ו- DNA בבעלי חיים וצמחים, אבל זה פחות בשימוש בתחום הפתולוגיה הצמחית ולא פותח היטב. במאמר זה, אנו מתארים את התהליך הניסיוני ואת שיטת הפעולה של ChIP-seq כדי לזהות את ההתפלגות הגנום כולו של מתילציה histone (כגון H3K4me3) שנקשרת לגנים היעד הפונקציונלי ב M. oryzae. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
אפיגנטיקה היא ענף של מחקר גנטי המתייחס לשינוי המשתי של ביטוי הגנים מבלי לשנות את רצף הנוקלאוטידים של הגנים. מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי רגולציה אפיגנטית ממלאת תפקיד חשוב בצמיחה ובהתפתחות של תאים אאוקריוטים, כולל כרומטין המסדיר ומשפיע על ביטוי הגנים באמצעות התהליך הדינמי של קיפול והרכבה למבנים מסדר גבוה יותר1,2. שיפוץ כרומטין ושינוי histone קוולנטי משפיעים ומווסתים את התפקוד והמבנה של הכרומטין באמצעות וריאציה של פולימרים כרומטין, ובכך להשיג את הפונקציה של ויסות ביטויגנים 3,4,5,6. שינויים פוסט-יבשתיים של היסטון כוללים אצטילציה, זרחן, מתילציה, מונוביקוויטינציה, סומוילציה, ריבוזילציה ADP7,8,9. Histone H3K4 מתילציה, במיוחד טרימתילציה, מופתה לאתרי התחלת תמלול שבהם היא קשורה לשכפול תמלול, רקומבינציה, תיקון ועיבוד RNA באאוקריוטים10,11.
טכנולוגיית ChIP-seq הוצגה בשנת 2007 והפכה לסטנדרט הניסיוני לניתוח כלל הגנום של רגולציה תמלולית ומנגנונים אפיגנטיים12,13. שיטה זו מתאימה בקנה מידה רחב הגנום ולקבלת מידע אינטראקציה histone או גורם שעתוק, כולל מקטעי DNA של חלבונים מחייב DNA. כל רצפי דנ”א המקושרים לחלבונים מעניינים יעברו חלק מתסביך הכרומטין. טכניקות רצף מהדור החדש משמשות גם לרצף של 36-100 bp של DNA, אשר מותאמות לאחר מכן לגנום היעד המתאים.
בפטריות פיטופתיות, מחקרים החלו לאחרונה לחקור כיצד שינויים מתילציה histone לווסת את הגנים היעד שלהם בתהליך של פתוגניות. כמה מחקרים קודמים הוכיחו כי הרגולציה של גנים הקשורים histone מתילאז באה לידי ביטוי בעיקר השתקת גנים וזרז את הייצור של מטבוליטים משניים (SM). MoSet1 הוא מתילאז H3K4 ב M. oryzae. הסתרה של גן זה גורמת למחיקה מלאה של שינוי H3K4me314. בהשוואה לזן מסוג בר, הביטוי של הגן MoCEL7C במוטנט מעוכב במצב המושרה CMC ובמצב שאינו מושרה (גלוקוז או תאית), הביטוי של MoCEL7C גדל15. ב פוסאריום גרמינדרום, KMT6 יכול לזרז את שינוי המתילציה של H3K27me3, לווסת את ההתפתחות הרגילה של פטריות, ולעזור לווסת את “הגנום המסתורי” המכיל את אשכול הגנים SM16,17,18,19. בשנת 2013, קונולי דיווח כי H3K9 ו H3K27 מתילציה מסדיר את התהליך הפתוגניים של פטריות באמצעות מטבוליטים משניים וגורמי אפקט המסדירים את עיכוב של גנים היעד20. באספרגילוס, השינוי של היסטיונים H3K4me2 ו- H3K4me3 קשור להפעלת גנים וממלא תפקיד חשוב בשליטה על רמת הכרומטין רגולציה של אשכולות גנים SM21. ב M. oryzae, טיג1 (הומולוג ל-Tig1 בשמרים ויונקים) הוא ה-HADC (histone deacetylase)22. נוקאאוט של הגן Tig1 מוביל לאובדן מוחלט של פתוגניות ויכולת ייצור נבגים במוטנט האפס. זה רגיש יותר לסביבת peroxygen, אשר לא יכול לייצר hyphae זיהומי22.
פיצוץ האורז שנגרם על ידי M. oryzae. הוא אחת ממחלות האורז החמורות ביותר ברוב האזורים גידול אורז בעולם19. בשל תהליך ההדבקה הייצוגי שלה, M. oryzae דומה לתהליך ההדבקה של פטריות פתוגניות חשובות רבות. כפי שהוא יכול בקלות לבצע פעולות גנטיות מולקולריות, הפטרייה הפכה אורגניזם מודל לחקר אינטראקציות פטריות-צמח23. חסימת כל שלב של תהליך ההדבקה של M. oryzae עלולה לגרום לזיהום לא מוצלח. השינויים המורפולוגיים במהלך תהליך ההדבקה מוסדרים בקפדנות על ידי כל פונקציית הגנום ותעתיק הגנים. ביניהם, שינויים אפיגנטיים כגון מתיליציה histone לשחק תפקיד חיוני ברגולציה שעתוק של גנים פונקציונליים24,25. עם זאת, עד כה, מחקרים מעטים נעשו על המנגנון המולקולרי של שינויים אפיגנטיים כגון מתילציה histone ואצטילציה histone בתעתיק של פתוגנזה גנים M. oryzae. לכן, פיתוח נוסף של מנגנון הרגולציה האפיגנטית של פטריית פיצוץ האורז תוך כדי מחקר ברשת הרגולטורית במעלה ובמורד הזרם של הגנים הקשורים לפתוגניים אלה יסייע לפתח אסטרטגיות מניעה ובקרה של פיצוץ אורז.
עם התפתחות הגנומיקה התפקודית כגון ChIP-seq, במיוחד באפיגנטיקה, שיטת רכישת נתונים בעלת תפוקה גבוהה זו האיצה את המחקר על כרומוזומים. באמצעות הטכנולוגיה הניסיונית ChIP-seq, ניתן לזהות את ההפצה הרחבה של מתילציה של היסטון (כגון H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) ב- M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות. לכן, שיטה זו יכולה לעזור להדגיש את המנגנונים המולקולריים שבבסיס האופן שבו שינויים אפיגנטיים מווסתים את הגנים היעד המועמד שלהם במהלך פתוגנזה פטרייתית בפתולוגיה של הצמח.
לאחרונה, ChIP-seq הפך שיטת ניתוח גנומית בשימוש נרחב לקביעת אתרי הכריכה של TFs או אתרי העשרה שהשתנו על ידי היסטיונים ספציפיים. בהשוואה לטכנולוגיית ChIP-seq הקודמת, טכנולוגיית ChIP-seq החדשה רגישה וגמישה מאוד. התוצאות מסופקות ברזולוציה גבוהה ללא השפעות שליליות, כגון אות הרעש הנגרם על ידי הכלאה לא ספציפי…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Grant no. 31871638), פרויקט המחקר המדעי המיוחד של אוניברסיטת החקלאות של בייג’ינג (YQ201603), הפרויקט המדעי של ועדת החינוך של בייג’ינג (KM201610020005), פרויקט גידול המחקר המדעי ברמה גבוהה של BUA (GJB2021005).
acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |