Genomweite Analyse der Histonmodifikationsverteilung mit der Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungsmethode in Magnaporthe Oryzae
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der genomweiten Verteilung von Histonmodifikationen vor, das neue Zielgene in der Pathogenese von M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifizieren kann.
Abstract
Die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq) ist eine leistungsstarke und weit verbreitete molekulare Technik zur Kartierung ganzer Genomstandorte von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatinregulatoren und Histonmodifikationen sowie zum Nachweis ganzer Genome zur Aufdeckung von TF-Bindungsmustern und histon-posttranslationalen Modifikationen. Chromatinmodifizierende Aktivitäten, wie die Histonmethylierung, werden oft für bestimmte genregulatorische Sequenzen rekrutiert, was zu lokalisierten Veränderungen in Chromatinstrukturen führt und zu spezifischen transkriptionellen Effekten führt. Die Reisexplosion ist eine verheerende Pilzkrankheit auf Reis auf der ganzen Welt und ist ein Modellsystem zur Untersuchung der Pilz-Pflanzen-Interaktion. Die molekularen Mechanismen, wie die Histonmodifikationen ihre Virulenzgene in Magnaporthe Oryzae regulieren, bleiben jedoch schwer fassbar. Mehr Forscher müssen ChIP-seq verwenden, um zu untersuchen, wie histone epigenetische Modifikationen ihre Zielgene regulieren. ChIP-seq wird auch häufig verwendet, um die Wechselwirkung zwischen Protein und DNA in Tieren und Pflanzen zu untersuchen, aber es wird weniger im Bereich der Pflanzenpathologie verwendet und ist nicht gut entwickelt. In diesem Artikel beschreiben wir den experimentellen Prozess und die Funktionsweise von ChIP-seq, um die genomweite Verteilung der Histonmethylierung (wie H3K4me3) zu identifizieren, die an die funktionellen Zielgene in M. oryzae bindet. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der genomweiten Verteilung von Histonmodifikationen vor, das neue Zielgene in der Pathogenese von M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifizieren kann.
Introduction
Die Epigenetik ist ein Zweig der Genforschung, der sich auf die vererbbare Veränderung der Genexpression bezieht, ohne die Nukleotidsequenz von Genen zu verändern. Eine zunehmende Anzahl von Studien hat gezeigt, dass die epigenetische Regulation eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung eukaryotischer Zellen spielt, einschließlich Chromatin, das die Genexpression durch den dynamischen Prozess der Faltung und Dessempfle in Strukturen höherer Ordnung reguliert und beeinflusst1,2. Chromatin-Remodeling und kovalente Histonmodifikation beeinflussen und regulieren die Funktion und Struktur von Chromatin durch die Variation von Chromatinpolymeren und erreichen dadurch die Funktion der Regulierung der Genexpression3,4,5,6. Posttranslationale Modifikationen des Histons umfassen Acetylierung, Phosphorylierung, Methylierung, Monoubiquitinierung, Sumoylierung und ADP-Ribosylierung7,8,9. Die Histon-H3K4-Methylierung, insbesondere die Trimethylierung, wurde an Transkriptionsstartstellen abgebildet, wo sie mit der Transkriptionsreplikation, Rekombination, Reparatur und RNA-Verarbeitung in Eukaryoten10,11assoziiert ist.
Die ChIP-seq-Technologie wurde 2007 eingeführt und hat sich zum experimentellen Standard für die genomweite Analyse der transkriptionellen Regulation und epigenetischen Mechanismen entwickelt12,13. Diese Methode eignet sich auf genomweiter Ebene und zur Gewinnung von Histon- oder Transkriptionsfaktor-Interaktionsinformationen, einschließlich DNA-Segmenten von DNA-bindenden Proteinen. Alle DNA-Sequenzen, die mit interessanten Proteinen vernetzt sind, werden als Teil des Chromatinkomplexes kopräzipitiert. Sequenzierungstechniken der neuen Generation werden auch verwendet, um 36-100 bp DNA zu sequenzieren, die dann mit dem entsprechenden Zielgenom abgeglichen werden.
Bei phytopathogenen Pilzen hat die Forschung kürzlich begonnen, zu untersuchen, wie Histonmethylierungsmodifikationen ihre Zielgene im Prozess der Pathogenität regulieren. Einige frühere Studien haben gezeigt, dass sich die Regulation von Histonmethylase-verwandten Genen hauptsächlich in der Genschminken und Katalyse der Produktion von Sekundärmetaboliten (SM) widerspiegelt. MoSet1 ist die H3K4-Methylase in M. oryzae. Der Knockout dieses Gens führt zur vollständigen Deletion der H3K4me3-Modifikation14. Im Vergleich zum Wildtyp-Stamm wird die Expression des Gens MoCEL7C in der Mutante im CMC-induzierten Zustand gehemmt und im nicht induzierten Zustand (Glukose oder Cellobiose) erhöhte sich die Expression von MoCEL7C um 15. In Fusarium graminearumkann KMT6 die Methylierungsmodifikation von H3K27me3 katalysieren, die normale Entwicklung von Pilzen regulieren und helfen, das “kryptische Genom” zu regulieren, das den SM-Gencluster16,17,18,19 enthält. Im Jahr 2013 berichtete Connolly, dass die H3K9- und H3K27-Methylierung den pathogenen Prozess von Pilzen durch sekundäre Metaboliten und Effektorfaktoren reguliert, die die Hemmung von Zielgenen regulieren20. Bei Aspergillusist die Modifikation der Histone H3K4me2 und H3K4me3 mit der Genaktivierung verbunden und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Chromatinspiegelregulation von SM-Genclustern21. In M. oryzaeist Tig1 (homolog zu Tig1 in Hefe und Säugetieren) eine HADC (Histon-Deacetylase)22. Der Knockout des Tig1-Gens führt zum vollständigen Verlust der Pathogenität und der Sporenproduktionsfähigkeit in der Nullmutante. Es ist empfindlicher gegenüber einer Persauerstoffumgebung, die keine infektiöse Hyphen produzieren kann22.
Die durch M. oryzae. verursachte Reisexplosion ist eine der schwersten Reiskrankheiten in den meisten Reisanbaugebieten der Welt19. Aufgrund seines repräsentativen Infektionsprozesses ähnelt M. oryzae dem Infektionsprozess vieler wichtiger pathogener Pilze. Da er leicht molekulargenetische Operationen durchführen kann, ist der Pilz zu einem Modellorganismus für die Untersuchung von Pilz-Pflanzen-Interaktionen geworden23. Das Blockieren jedes Schritts des Infektionsprozesses von M. oryzae kann zu einer erfolglosen Infektion führen. Die morphologischen Veränderungen während des Infektionsprozesses werden durch die gesamte Genomfunktion und Die Gentranskription streng reguliert. Unter ihnen spielen epigenetische Modifikationen wie die Histonmethylierung eine wesentliche Rolle bei der transkriptionellen Regulation funktioneller Gene24,25. Bisher wurden jedoch nur wenige Studien zum molekularen Mechanismus epigenetischer Modifikationen wie Histonmethylierung und Histonacetylierung bei der Transkription von Pathogenesegenen in M. oryzae durchgeführt. Daher wird die Weiterentwicklung des epigenetischen Regulationsmechanismus des Reisblastenpilzes während der Erforschung des vor- und nachgelagerten Regulatorischen Netzwerks dieser pathogen verwandten Gene dazu beitragen, Strategien zur Prävention und Bekämpfung von Reisexplosionen zu entwickeln.
Mit der Entwicklung funktioneller Genomik wie ChIP-seq, insbesondere in der Epigenetik, hat diese Hochdurchsatz-Datenerfassungsmethode die Chromosomenforschung beschleunigt. Mit der experimentellen Technologie ChIP-seq kann die genomweite Verteilung der Histonmethylierung (wie H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifiziert werden. Daher kann diese Methode helfen, die molekularen Mechanismen zu klären, die zugrunde liegen, wie epigenetische Modifikationen ihre Kandidaten-Zielgene während der Pilzpathogenese in der Pflanzenpathologie regulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In jüngster Zeit hat sich ChIP-seq zu einer weit verbreiteten genomischen Analysemethode zur Bestimmung der Bindungsstellen von TFs oder Anreicherungsstellen, die durch bestimmte Histone modifiziert wurden, zu einem weit verbreiteten. Im Vergleich zur bisherigen ChIP-seq-Technologie ist die neue ChIP-seq-Technologie hochsensibel und flexibel. Die Ergebnisse werden in hoher Auflösung ohne negative Auswirkungen geliefert, wie z.B. das Rauschsignal, das durch die unspezifische Hybridisierung von Nukleinsäuren verursacht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen 31871638), dem Special Scientific Research Project der Beijing Agriculture University (YQ201603), dem Scientific Project des Beijing Educational Committee (KM201610020005), dem High-level scientific research cultivation project der BUA (GJB2021005) unterstützt.
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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