マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析
Summary
ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。
Abstract
クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子(TF)、クロマチン調節因子、ヒストン修飾の全ゲノム位置をマッピングし、TF結合パターンおよびヒストンポスト修飾を明らかにするための全ゲノムを検出するための強力で広く使用されている分子技術です。ヒストンメチル化などのクロマチン修飾作用は、特定の遺伝子調節配列に採用されることが多く、クロマチン構造の局所的な変化を引き起こし、特定の転写効果を生じる。米の爆発は、世界中の米に壊滅的な真菌病であり、真菌と植物の相互作用を研究するためのモデルシステムです。しかし、ヒストン修飾が Magnaporthe oryzae の毒性遺伝子をどのように調節するかの分子メカニズムは依然として不可解である。より多くの研究者は、ヒストンエピジェネティック修飾が標的遺伝子をどのように調節するかを研究するためにChIP-seqを使用する必要があります。また、動物や植物のタンパク質とDNAの相互作用を研究するために広く使用されていますが、植物病理学の分野ではあまり使用されておらず、十分に開発されていません。本論文では 、M.オリザ エの機能性標的遺伝子に結合するヒストンメチル化(H3K4me3など)のゲノム全体分布を同定するための、ChIP-seqの実験過程と操作方法について述べた。ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。
Introduction
エピジェネティクスは、遺伝子の塩基配列を変化させることなく遺伝子発現の遺伝性変化を指す遺伝子研究の一分野です。エピジェネティックな調節が真核細胞の増殖と発達において重要な役割を果たしていることを示す研究が増えているが、折りたたみと組み立ての動的過程を通じて遺伝子発現を制御し、影響を与えるクロマチンを含む1,2.クロマチンリモデリングおよび共有ヒストン修飾は、クロマチンポリマーの変動を通じてクロマチンの機能および構造に影響を及ぼし、それにより遺伝子発現3、4、5、6を調節する機能を達成する。ヒストンの翻訳後修飾には、アセチル化、リン酸化、メチル化、モノユビキチン化、相総化、およびADPリボシル化7、8、9が含まれる。ヒストンH3K4メチル化、特にトリメチル化は、真核生物10,11における転写複製、再結合、修復、およびRNA処理に関連する転写開始部位にマッピングされている。
ChIP-seq技術は2007年に導入され、転写制御およびエピジェネティック機構12,13のゲノム全体解析の実験基準となっている。この方法は、ゲノムワイドスケールで、DNA結合タンパク質のDNAセグメントを含むヒストンまたは転写因子相互作用情報を得るのに適している。目的のタンパク質に架橋されたDNA配列は、クロマチン複合体の一部として共沈殿します。新世代シーケンシング技術は、36-100bpのDNAを配列するためにも使用され、その後、対応する標的ゲノムと一致する。
植物病原性真菌では、最近、ヒストンメチル化修飾が病原性の過程で標的遺伝子をどのように調節するかを研究し始めている。いくつかの以前の研究は、ヒストンメチラーゼ関連遺伝子の調節が主に遺伝子サイレンシングおよび二次代謝産物(SM)の産生を触媒することに反映されることを証明した。MoSet1は、MオリザエのH3K4メチラーゼです。この遺伝子のノックアウトは、H3K4me3改変14の完全な欠失をもたらす。野生型株と比較して、変異体における遺伝子MoCEL7Cの発現は、CMC誘発状態および非誘導状態(グルコースまたはセロビオース)において阻害され、MoCEL7Cの発現は15増加した。Fusarium graminearumでは、KMT6はH3K27me3のメチル化修飾を触媒し、真菌の正常な発達を調節し、SM遺伝子クラスター16、17、18、19を含む「暗号ゲノム」を調節するのに役立つ。2013年、コノリーは、H3K9およびH3K27メチル化が、標的遺伝子20の阻害を調節する二次代謝産物およびエフェクター因子を通じて真菌の病原性プロセスを調節すると報告した。アスペルギルスにおいて、ヒストンH3K4me2およびH3K4me3の改変は、遺伝子活性化に関連しており、SM遺伝子クラスター21のクロマチンレベル調節を制御する上で重要な役割を果たす。M.オリザエにおいて、Tig1(酵母および哺乳動物におけるTig1に相同性)はHADC(ヒストンデアセチラーゼ)22である。Tig1遺伝子のノックアウトは、ヌル突然変異体における病原性および胞胞体産生能力の完全な喪失をもたらす。感染性ヒphphae22を産生できない過酸素環境に対してより敏感である。
M.oryzae.によって引き起こされる米の爆発は、世界で最も深刻な米の病気の一つです19.その代表的な感染過程のために、M.oryzaeは多くの重要な病原性真菌の感染過程に類似している。容易に分子遺伝学的操作を行うことができるので、真菌は真菌と植物の相互作用を研究するためのモデル生物23となっている。M.オリザエの感染過程のすべてのステップを遮断すると、感染が失敗する可能性があります。感染過程における形態変化は、ゲノム機能全体と遺伝子転写によって厳密に調節される。中でも、ヒストンメチル化などのエピジェネティック修飾は、機能性遺伝子24,25の転写調節に不可欠な役割を果たす。しかし、これまでのところ、M.オリザエにおける病原性遺伝子の転写におけるヒストンメチル化およびヒストンアセチル化などのエピジェネティック修飾の分子機構に関する研究はほとんど行われていない。したがって、これらの病原性遺伝子の上流および下流の調節ネットワークを研究しながら、稲芽菌のエピジェネティックな調節機構をさらに開発することは、米爆風予防および制御戦略の開発に役立つ。
特にエピジェネティクスにおけるChIP-seqなどの機能性ゲノミクスの開発により、このハイスループットデータ取得法により染色体の研究が加速されました。ChIP-seq実験技術を用いて 、M.オリザエ および他の糸状菌におけるヒストンメチル化(H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3など)のゲノム全体の分布を同定することができる。したがって、この方法は、エピジェネティック修飾が植物病理における真菌病因の間に候補標的遺伝子を調節する方法の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。
Protocol
Representative Results
Discussion
近年、ChIP-seqは、特定のヒストンによって改変されたTFまたは濃縮部位の結合部位を決定するためのゲノム解析法として広く用いられている。従来のChIP-seqテクノロジーと比較すると、新しいChIP-seq技術は高感度で柔軟性に優れています。核酸の非特異的なハイブリダイゼーションによって生じるノイズ信号など、負の影響を受けることなく高解像度で得られます。これは一般的な遺伝子発現?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(31871638グラント)、北京農業大学特別科学研究プロジェクト(YQ201603)、北京教育委員会の科学プロジェクト(KM201610020005)、BUA(GJB2021005)の高レベル科学研究育成プロジェクトによって支援されました。
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
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