Summary

Análise em todo o genoma da distribuição de modificações de histona usando o Método de Sequenciamento de Imunoprecipitação de Chromatina em Magnaporthe oryzae

Published: June 02, 2021
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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.

Abstract

O sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq) é uma técnica molecular poderosa e amplamente utilizada para mapear locais inteiros do genoma de fatores de transcrição (TFs), reguladores de cromatina e modificações de histona, bem como detectar genomas inteiros para descobrir padrões de ligação TF e modificações pós-translationais de histona. Atividades modificadoras de cromatina, como a metilação de histona, são frequentemente recrutadas para sequências regulatórias genéticas específicas, causando alterações localizadas nas estruturas de cromatina e resultando em efeitos transcricionais específicos. A explosão de arroz é uma doença fúngica devastadora no arroz em todo o mundo e é um sistema modelo para estudar a interação fungo-planta. No entanto, os mecanismos moleculares em como as modificações de histona regulam seus genes de virulência em Magnaporthe oryzae permanecem evasivos. Mais pesquisadores precisam usar o ChIP-seq para estudar como a modificação epigenética histona regula seus genes-alvo. O ChIP-seq também é amplamente utilizado para estudar a interação entre proteína e DNA em animais e plantas, mas é menos utilizado no campo da patologia vegetal e não foi bem desenvolvido. Neste artigo, descrevemos o processo experimental e o método de operação do ChIP-seq para identificar a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3) que se liga aos genes-alvo funcionais em M. oryzae. Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.

Introduction

Epigenética é um ramo de pesquisa genética que se refere à mudança hereditária da expressão genética sem alterar a sequência nucleotídea dos genes. Um número crescente de estudos tem demonstrado que a regulação epigenética desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento de células eucarióticas, incluindo a cromatina que regula e afeta a expressão genética através do processo dinâmico de dobra e montagem em estruturas de altaordem 1,2. A remodelação da cromatina e a modificação da histona covalente afetam e regulam a função e a estrutura da cromatina através da variação dos polímeros de cromatina, alcançando assim a função de regular a expressão genética3,4,5,6. As modificações pós-transacionais da histona incluem acetilação, fosforilação, metilação, monoubiquização, sumôilação e ribossilação ADP7,8,9. A metilação histona H3K4, particularmente a trimetilação, foi mapeada para locais de início de transcrição onde está associada à replicação de transcrição, recombinação, reparo e processamento de RNA em eucariotes10,11.

A tecnologia ChIP-seq foi introduzida em 2007 e tornou-se o padrão experimental para a análise em todo o genoma da regulação transcricional e dos mecanismos epigenéticos12,13. Este método é adequado na escala genoma-em toda-genoma e para a obtenção de informações de interação de histona ou fator de transcrição, incluindo segmentos de DNA de proteínas de ligação de DNA. Qualquer sequência de DNA cruzada a proteínas de interesse coprecipitará como parte do complexo de cromatina. Técnicas de sequenciamento de nova geração também são usadas para sequenciar 36-100 bp de DNA, que são então combinadas com o genoma alvo correspondente.

Em fungos fitopatômicos, a pesquisa começou recentemente a estudar como modificações de metilação de histona regulam seus genes-alvo no processo de patogenicidade. Alguns estudos anteriores provaram que a regulação de genes relacionados à histona methylase é refletida principalmente no silenciamento genético e na catalisação da produção de Metabólitos Secundários (SM). MoSet1 é o metilase H3K4 em M. oryzae. O nocaute deste gene resulta na exclusão completa da modificação H3K4me314. Em comparação com a cepa do tipo selvagem, a expressão do gene MoCEL7C no mutante é inibida no estado induzido pelo CMC e no estado não induzido (glicose ou celobiose), a expressão de MoCEL7C aumentou15. Em Fusarium graminearum, KMT6 pode catalisar a modificação da metilação de H3K27me3, regular o desenvolvimento normal de fungos e ajudar a regular o “genoma enigmático” contendo o aglomerado genético SM16,17,18,19. Em 2013, Connolly relatou que a metilação H3K9 e H3K27 regula o processo patogênico de fungos através de metabólitos secundários e fatores efeitos que regulam a inibição dos genes-alvo20. Em Aspergillus,a modificação das histonas H3K4me2 e H3K4me3 está relacionada à ativação genética e desempenha um papel importante no controle da regulação do nível de cromatina dos aglomerados genéticos SM21. Em M. oryzae, Tig1 (homólogo de Tig1 em leveduras e mamíferos) é um HADC (histone deacetylase)22. Nocaute do gene Tig1 leva à perda completa da patogenicidade e capacidade de produção de esporos no mutante nulo. É mais sensível a um ambiente peroxígeno, que não pode produzir hifasinfecciosas 22.

A explosão de arroz causada por M. oryzae. é uma das doenças de arroz mais graves na maioria das áreas de cultivo de arroz no mundo19. Devido ao seu processo de infecção representativa, M. oryzae é semelhante ao processo de infecção de muitos fungos patogênicos importantes. Como pode facilmente realizar operações genéticas moleculares, o fungo tornou-se um organismo modelo para estudar as interações fúngicos-vegetais23. Bloquear cada etapa do processo de infecção de M. oryzae pode resultar em infecção mal sucedida. As alterações morfológicas durante o processo de infecção são estritamente reguladas por toda a função do genoma e transcrição genética. Entre elas, modificações epigenéticas como a metilação de histona desempenham um papel essencial na regulação transcricional dos genes funcionais24,25. No entanto, até agora, poucos estudos foram feitos sobre o mecanismo molecular de modificações epigenéticas como a metilação de histona e acetilação de histona na transcrição de genes de patogênese em M. oryzae. Portanto, desenvolver ainda mais o mecanismo de regulação epigenética do fungo da explosão de arroz, enquanto pesquisa a rede reguladora a montante e a jusante desses genes relacionados à patogenicidade ajudará a desenvolver estratégias de prevenção e controle da explosão de arroz.

Com o desenvolvimento de genômicas funcionais como o ChIP-seq, especialmente na epigenética, este método de aquisição de dados de alto rendimento acelerou a pesquisa sobre cromossomos. Usando a tecnologia experimental ChIP-seq, a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) em M. oryzae e outros fungos filamentosos pode ser identificada. Portanto, este método pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à forma como modificações epigenéticas regulam seus genes alvos candidatos durante a patogênese fúngica na patologia vegetal.

Protocol

1. Preparação de protoplastos de M. oryzae Prepare o ágar de aveia-tomate (OTA). Pese 30-50 g de aveia e ferva-a em 800 mL de água (ddH2O) por 20 min. Filtre duas camadas de gaze e pegue a filtrada. Pegue tomates maduros e descasque-os. Esprema o suco e filtre duas camadas de gaze para coletar 150 mL do suco filtrado. Misture todo o suco de tomate e a aveia preparada filtrar bem e adicione ddH2O até 1000 mL. Adicione 250 mL do OTA e 2,…

Representative Results

Todo o fluxograma do método ChIP-seq é mostrado na Figura 1. Os experimentos chIP-seq foram realizados usando anticorpos contra H3K4me3 na cepa de tipo selvagem P131 e três cepas mutantes nulas que eram desprovidas de mobre2, mospp1e gene moswd2 para verificar todo o perfil genoma da distribuição histone H3K4me3 em M. oryzae. Os protoplastos da cepa do tipo selvagem, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2, foram preparados e sonicados…

Discussion

Recentemente, o ChIP-seq tornou-se um método de análise genômica amplamente utilizado para determinar os locais de vinculação de TFs ou locais de enriquecimento modificados por histones específicos. Em comparação com a tecnologia ChIP-seq anterior, a nova tecnologia ChIP-seq é altamente sensível e flexível. Os resultados são fornecidos em alta resolução sem efeitos negativos, como o sinal de ruído causado pela hibridização não específica dos ácidos nucleicos. Embora esta seja uma análise comum de exp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), pelo Special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), pelo Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM20161002005), o projeto de cultivo de pesquisa científica de alto nível da BUA (GJB2021005).

Materials

acidic casein hydrolysate WAKO 65072-00-6 Medium configuration
agar powder scientan 9002-18-0 Medium configuration
deoxycholic acid MedChemExpress 83-44-3 protein and dissolution
DNA End-Repair kit NovoBiotec ER81050 Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads Invitrogen no.100.02D Binding target
EB buffer JIMEI JC2174 Membrane and liquid
EDTA ThermoFisher AM9912 protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate Sigma 91079-40-2 Medium configuration
glucose Sigma 50-99-7 Medium configuration
glycogen ThermoFisher AM9510 Precipitant action
H3K4me3 antibodies Abcam ab8580 Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer illumina illumina Hiseq 2000 Large configuration
Illumina PCR primers illumina CleanPlex Random universal primer
isoamyl alcohol chemical book 30899-19-5 Purified DNA
LiCl ThermoFisher AM9480 specific removal RNA
lysing enzymes Sigma L1412-10G cell lysis buffer
Mouse IgG Yeasen 36111ES10 Animal normal immunoglobulin
NaCl solution ThermoFisher 7647-14-5 Medium configuration
NaHCO3 Seebio SH30173.08* preparation of protein complex eluent
NP-40 ThermoFisher 85124 cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit Qiagen 28004 The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors ThermoFisher A32965 A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K ThermoFisher AM2546 DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0 ThermoFisher Q33226 Medium configuration
RIPA buffer ThermoFisher 9806S cell lysis buffer
RNase A ThermoFisher AM2271 Purified DNA
SDS ThermoFisher AM9820 cover up the charge differences
sodium acetate solution ThermoFisher R1181 Acetic acid buffer
sodium deoxycholate ThermoFisher 89904 inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase ThermoFisher EL0011 Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer ThermoFisher B69 DNA ligase buffer
Tris-HCl ThermoFisher 1185-53-1 buffer action
Triton X-100 ThermoFisher HFH10 keep the membrane protein stable
yeast extract OXOID LP0021 Medium configuration

References

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Wu, Z., Sun, W., Zhou, S., Zhang, L., Zhao, X., Xu, Y., Wang, W. Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae. J. Vis. Exp. (172), e62423, doi:10.3791/62423 (2021).

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