Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.
O sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq) é uma técnica molecular poderosa e amplamente utilizada para mapear locais inteiros do genoma de fatores de transcrição (TFs), reguladores de cromatina e modificações de histona, bem como detectar genomas inteiros para descobrir padrões de ligação TF e modificações pós-translationais de histona. Atividades modificadoras de cromatina, como a metilação de histona, são frequentemente recrutadas para sequências regulatórias genéticas específicas, causando alterações localizadas nas estruturas de cromatina e resultando em efeitos transcricionais específicos. A explosão de arroz é uma doença fúngica devastadora no arroz em todo o mundo e é um sistema modelo para estudar a interação fungo-planta. No entanto, os mecanismos moleculares em como as modificações de histona regulam seus genes de virulência em Magnaporthe oryzae permanecem evasivos. Mais pesquisadores precisam usar o ChIP-seq para estudar como a modificação epigenética histona regula seus genes-alvo. O ChIP-seq também é amplamente utilizado para estudar a interação entre proteína e DNA em animais e plantas, mas é menos utilizado no campo da patologia vegetal e não foi bem desenvolvido. Neste artigo, descrevemos o processo experimental e o método de operação do ChIP-seq para identificar a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3) que se liga aos genes-alvo funcionais em M. oryzae. Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.
Epigenética é um ramo de pesquisa genética que se refere à mudança hereditária da expressão genética sem alterar a sequência nucleotídea dos genes. Um número crescente de estudos tem demonstrado que a regulação epigenética desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento de células eucarióticas, incluindo a cromatina que regula e afeta a expressão genética através do processo dinâmico de dobra e montagem em estruturas de altaordem 1,2. A remodelação da cromatina e a modificação da histona covalente afetam e regulam a função e a estrutura da cromatina através da variação dos polímeros de cromatina, alcançando assim a função de regular a expressão genética3,4,5,6. As modificações pós-transacionais da histona incluem acetilação, fosforilação, metilação, monoubiquização, sumôilação e ribossilação ADP7,8,9. A metilação histona H3K4, particularmente a trimetilação, foi mapeada para locais de início de transcrição onde está associada à replicação de transcrição, recombinação, reparo e processamento de RNA em eucariotes10,11.
A tecnologia ChIP-seq foi introduzida em 2007 e tornou-se o padrão experimental para a análise em todo o genoma da regulação transcricional e dos mecanismos epigenéticos12,13. Este método é adequado na escala genoma-em toda-genoma e para a obtenção de informações de interação de histona ou fator de transcrição, incluindo segmentos de DNA de proteínas de ligação de DNA. Qualquer sequência de DNA cruzada a proteínas de interesse coprecipitará como parte do complexo de cromatina. Técnicas de sequenciamento de nova geração também são usadas para sequenciar 36-100 bp de DNA, que são então combinadas com o genoma alvo correspondente.
Em fungos fitopatômicos, a pesquisa começou recentemente a estudar como modificações de metilação de histona regulam seus genes-alvo no processo de patogenicidade. Alguns estudos anteriores provaram que a regulação de genes relacionados à histona methylase é refletida principalmente no silenciamento genético e na catalisação da produção de Metabólitos Secundários (SM). MoSet1 é o metilase H3K4 em M. oryzae. O nocaute deste gene resulta na exclusão completa da modificação H3K4me314. Em comparação com a cepa do tipo selvagem, a expressão do gene MoCEL7C no mutante é inibida no estado induzido pelo CMC e no estado não induzido (glicose ou celobiose), a expressão de MoCEL7C aumentou15. Em Fusarium graminearum, KMT6 pode catalisar a modificação da metilação de H3K27me3, regular o desenvolvimento normal de fungos e ajudar a regular o “genoma enigmático” contendo o aglomerado genético SM16,17,18,19. Em 2013, Connolly relatou que a metilação H3K9 e H3K27 regula o processo patogênico de fungos através de metabólitos secundários e fatores efeitos que regulam a inibição dos genes-alvo20. Em Aspergillus,a modificação das histonas H3K4me2 e H3K4me3 está relacionada à ativação genética e desempenha um papel importante no controle da regulação do nível de cromatina dos aglomerados genéticos SM21. Em M. oryzae, Tig1 (homólogo de Tig1 em leveduras e mamíferos) é um HADC (histone deacetylase)22. Nocaute do gene Tig1 leva à perda completa da patogenicidade e capacidade de produção de esporos no mutante nulo. É mais sensível a um ambiente peroxígeno, que não pode produzir hifasinfecciosas 22.
A explosão de arroz causada por M. oryzae. é uma das doenças de arroz mais graves na maioria das áreas de cultivo de arroz no mundo19. Devido ao seu processo de infecção representativa, M. oryzae é semelhante ao processo de infecção de muitos fungos patogênicos importantes. Como pode facilmente realizar operações genéticas moleculares, o fungo tornou-se um organismo modelo para estudar as interações fúngicos-vegetais23. Bloquear cada etapa do processo de infecção de M. oryzae pode resultar em infecção mal sucedida. As alterações morfológicas durante o processo de infecção são estritamente reguladas por toda a função do genoma e transcrição genética. Entre elas, modificações epigenéticas como a metilação de histona desempenham um papel essencial na regulação transcricional dos genes funcionais24,25. No entanto, até agora, poucos estudos foram feitos sobre o mecanismo molecular de modificações epigenéticas como a metilação de histona e acetilação de histona na transcrição de genes de patogênese em M. oryzae. Portanto, desenvolver ainda mais o mecanismo de regulação epigenética do fungo da explosão de arroz, enquanto pesquisa a rede reguladora a montante e a jusante desses genes relacionados à patogenicidade ajudará a desenvolver estratégias de prevenção e controle da explosão de arroz.
Com o desenvolvimento de genômicas funcionais como o ChIP-seq, especialmente na epigenética, este método de aquisição de dados de alto rendimento acelerou a pesquisa sobre cromossomos. Usando a tecnologia experimental ChIP-seq, a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) em M. oryzae e outros fungos filamentosos pode ser identificada. Portanto, este método pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à forma como modificações epigenéticas regulam seus genes alvos candidatos durante a patogênese fúngica na patologia vegetal.
Recentemente, o ChIP-seq tornou-se um método de análise genômica amplamente utilizado para determinar os locais de vinculação de TFs ou locais de enriquecimento modificados por histones específicos. Em comparação com a tecnologia ChIP-seq anterior, a nova tecnologia ChIP-seq é altamente sensível e flexível. Os resultados são fornecidos em alta resolução sem efeitos negativos, como o sinal de ruído causado pela hibridização não específica dos ácidos nucleicos. Embora esta seja uma análise comum de exp…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), pelo Special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), pelo Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM20161002005), o projeto de cultivo de pesquisa científica de alto nível da BUA (GJB2021005).
acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |