Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

La retina de los vertebrados es un importante sistema modelo para estudiar el desarrollo neuronal. A pesar de su ubicación periférica, la retina es anatómica y evolutivamente una extensión del sistema nervioso central, y el nervio óptico, que consiste en axones de células ganglionares de la retina, representa un tracto dentro del sistema nervioso central. La retina del pollito tiene ventajas significativas como sistema modelo para estudiar el mecanismo molecular del desarrollo neuronal: es grande y se desarrolla rápidamente; tiene similitudes estructurales y funcionales con la retina humana; Es muy accesible para la visualización y las manipulaciones experimentales. Los mecanismos moleculares de proliferación y diferenciación celular, morfogénesis y guía de axones durante el desarrollo neuronal se han estudiado ampliamente mediante el uso de la retina de pollo.

La electroporación in ovo se ha utilizado con éxito durante las últimas dos décadas para introducir genes ectópicos en las células del embrión de pollo en desarrollo. Esta técnica permite el marcaje de las células en desarrollo, el rastreo del destino celular y el rastreo de la migración celular y los tractos axónicos, así como la expresión génica ectópica para el análisis in vivo de la función génica. Las condiciones de electroporación in ovo para la expresión génica ectópica eficiente en embriones de pollo han sido bien establecidas ^1,2,3.

A pesar de estas ventajas, la falta de una técnica estable de pérdida de función para el estudio de la función génica había sido una limitación técnica importante del embrión de pollo. Mientras que los embriones de pollo electroporados con pequeños ARN interferentes (siRNAs⁾⁴ o vectores de expresión de ARN de horquilla corta (shRNAs)⁵ muestran la eliminación del gen objetivo, la supresión génica en esos enfoques es transitoria porque los efectos desaparecen una vez que las células pierden los ARN o ADN introducidos. Se puede lograr una supresión génica más estable mediante la administración de siRNAs en embriones de pollo mediante un sistema de retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)⁶. El vector viral se integra en el genoma del huésped y los genes ectópicos se expresan de manera estable. Sin embargo, el retrovirus solo puede integrarse en el genoma de las células en división durante la fase mitótica (M) del ciclo celular, lo que puede imponer una limitación en las etapas de desarrollo y/o tipos de células para las que se puede aplicar este enfoque de pérdida de función. Además, la expresión de transgenes por RCAS parece más lenta y menos robusta que la inducida por electroporación in ovo ⁷.

Los transposones son elementos genéticos que se mueven de un lugar del genoma a otro. El elemento Tol2 es un miembro de la familia de elementos transponibles hAT y contiene un gen interno que codifica una transposasa que cataliza la reacción de transposón del elemento Tol2⁸. Cuando un vector plásmido que lleva un casete de expresión génica flanqueado por las secuencias de los extremos izquierdo y derecho de los elementos Tol2 (200 pb y 150 pb, respectivamente) se introduce en células de vertebrados con una construcción de expresión de transposasa Tol2, el casete de expresión se extirpa del plásmido y se integra en el genoma del huésped, lo que favorece una expresión estable del gen ectópico (Figura 1). Se ha demostrado que el elemento transponible Tol2 puede inducir la transposición de genes de manera muy eficiente en diferentes especies de vertebrados, incluidos el pez cebra^9,10, las ranas 11, los polluelos 12 y los ratones ^13, y por lo tanto es un método útil de transgénesis y mutagénesis insercional. El sistema de transposones Tol2 se ha utilizado con éxito para la eliminación condicional de un gen diana mediante la integración genómica del siRNA que se procesa a partir de ARN bicatenario^{largo 14}.

Este protocolo describe un abordaje de pérdida de función en el embrión de pollo que implica la introducción de microRNAs artificiales (miRNAs) por el sistema de transposones Tol2^15,16. En este enfoque, se clona un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y miARN artificiales contra un gen diana en un vector de transposón Tol2. A continuación, la construcción del transposón Tol2 se introduce en la retina del pollito embrionario con una construcción de expresión de la transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo. En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestros estudios previos, logramos reducir la expresión de Nel, una glicoproteína extracelular que se expresa predominantemente en el sistema nervioso, en la retina del pollo en desarrollo (ver Resultados representativos). Nuestros resultados indican que se puede lograr una supresión génica estable y eficiente in ovo mediante esta técnica.