Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ
Summary
我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo エレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて行う新しい機能喪失アプローチを開発しました。この技術は、発生中の遺伝子機能の研究のための堅牢で安定した遺伝子ノックダウン方法論を提供します。
Abstract
ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。
Introduction
脊椎動物の網膜は、神経発生を研究するための重要なモデルシステムです。その末梢位置にもかかわらず、網膜は解剖学的および発達的に中枢神経系の延長であり、網膜神経節細胞の軸索からなる視神経は中枢神経系内の管を表す。ひよこ網膜は、神経発達の分子メカニズムを研究するためのモデルシステムとして重要な利点があります:それは大きく、急速に発達します。それは人間の網膜と構造的および機能的類似性を持っています。視覚化や実験的な操作に非常にアクセスしやすいです。神経発生中の細胞増殖・分化、形態形成、軸索誘導の分子機構は、ニワトリ網膜を用いて広く研究されている。
卵子では、エレクトロポレーションは、発生中のニワトリ胚の細胞に異所性遺伝子を導入するために過去20年間にわたって首尾よく使用されてきました。この技術により、発生中の細胞の標識、細胞運命の追跡、細胞移動および軸索路のトレース、および遺伝子機能のin vivo分析のための異所性遺伝子発現が可能になります。ニワトリ胚における効率的な異所性遺伝子発現のためのin ovoエレクトロポレーションの条件は十分に確立されている1,2,3。
これらの利点にもかかわらず、遺伝子機能の研究のための安定した機能喪失技術の欠如は、ニワトリ胚の主要な技術的限界であった。低分子干渉RNA(siRNA)4やショートヘアピンRNA(shRNA)5の発現ベクターでエレクトロポレーションしたニワトリ胚は標的遺伝子のノックダウンを示しますが、これらのアプローチでは、導入されたRNAまたはDNAを失うと細胞が効果が消失するため、遺伝子抑制は一過性です。より安定した遺伝子抑制は、RCAS(RエプリケーションCompetent Avian slicoma-leukosisウイルス(ASLV)ロングターミナルリピート(LTR)とSプライスアクセプター)レトロウイルスシステム6によってニワトリ胚にsiRNAを送達することによって達成され得る。ウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子が安定に発現します。ただし、レトロウイルスは、細胞周期の有糸分裂(M)期にのみ分裂細胞のゲノムに組み込まれるため、この機能喪失アプローチを適用できる発生段階および/または細胞型に制限が課される可能性があります。さらに、RCASによる導入遺伝子の発現は、in ovoエレクトロポレーションによって誘導されるものよりも遅く、頑健ではないようです7。
トランスポゾンは、ゲノム上のある場所から別の場所に移動する遺伝的要素です。Tol2エレメントは、hAT転移エレメントファミリーのメンバーであり、Tol2エレメント8のトランスポゾン反応を触媒するトランスポザーゼをコードする内部遺伝子を含む。Tol2エレメントの左端と右端の配列(それぞれ200 bpと150 bp)に挟まれた遺伝子発現カセットを担持したプラスミドベクターをTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトで脊椎動物細胞に導入すると、プラスミドから発現カセットが切り出され、宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子の安定発現をサポートします(図1).Tol2転移因子は、ゼブラフィッシュ9,10、カエル11、ヒナ12、マウス13を含む異なる脊椎動物種において非常に効率的に遺伝子転位を誘導できることが示されており、したがって、遺伝子導入および挿入突然変異誘発の有用な方法である。Tol2トランスポゾン系は、長鎖二本鎖RNAからプロセシングされたsiRNAのゲノム組み込みによる標的遺伝子の条件付きノックダウンに使用されています14。
このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムによる人工マイクロRNA(miRNA)の導入を含むニワトリ胚における機能喪失アプローチを説明しています15,16。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーと標的遺伝子に対する人工miRNAの発現カセットをTol2トランスポゾンベクターにクローニングします。次いで、Tol2トランスポゾン構築物を、in ovoエレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現構築物と共に胚性ニワトリ網膜に導入する。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、主に神経系に発現する細胞外糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜でノックダウンすることに成功しました(代表的な結果を参照)。我々の結果は、この手法により、ovoにおいて安定的かつ効率的な遺伝子抑制を達成できることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、 in ovo エレクトロポレーションと Tol2 トランスポゾンシステムを用いた人工 miRNA のトランスジェニック発現による、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの詳細なガイドを提供します。
この手法を正常に実行するには、次の要素が非常に重要です。まず、堅牢なノックダウン効果を発揮することが確認されているmiRNA配列を使用…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pT2K-CAGGSおよびpCAGGS-T2TPベクターは、それぞれ高橋佳子(京都大学、京都)および川上浩一(国立遺伝学研究所、三島)から提供された。原稿を批判的に読んでくれたマイケル・ベルベログルに感謝します。この研究は、王立協会およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BBSRC)(英国)からM.N.への助成金によってサポートされました。
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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