Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

La retina dei vertebrati è un importante sistema modello per lo studio dello sviluppo neurale. Nonostante la sua posizione periferica, la retina è anatomicamente e dal punto di vista dello sviluppo un’estensione del sistema nervoso centrale e il nervo ottico, costituito da assoni di cellule gangliari retiniche, rappresenta un tratto all’interno del sistema nervoso centrale. La retina del pulcino presenta vantaggi significativi come sistema modello per studiare il meccanismo molecolare dello sviluppo neurale: è grande e si sviluppa rapidamente; presenta somiglianze strutturali e funzionali con la retina umana; È altamente accessibile per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. I meccanismi molecolari della proliferazione e della differenziazione cellulare, della morfogenesi e della guida degli assoni durante lo sviluppo neurale sono stati ampiamente studiati utilizzando la retina di pollo.

Nell’ovo, l’elettroporazione è stata utilizzata con successo negli ultimi due decenni per introdurre geni ectopici nelle cellule dell’embrione di pulcino in via di sviluppo. Questa tecnica consente la marcatura delle cellule in via di sviluppo, il tracciamento del destino cellulare e il tracciamento della migrazione cellulare e dei tratti assonici, nonché l’espressione genica ectopica per l’analisi in vivo della funzione genica. Le condizioni dell’elettroporazione in ovo per un’efficiente espressione genica ectopica negli embrioni di pulcino sono state ben stabilite ^1,2,3.

Nonostante questi vantaggi, la mancanza di una tecnica stabile di perdita di funzione per gli studi sulla funzione genica era stata una delle principali limitazioni tecniche dell’embrione di pulcino. Mentre gli embrioni di pulcino elettropostati con piccoli RNA interferenti (siRNAs)⁴ o vettori di espressione per RNA a forcina corta (shRNAs)⁵ mostrano knockdown del gene bersaglio, la soppressione genica in questi approcci è transitoria perché gli effetti scompaiono una volta che le cellule perdono gli RNA o i DNA introdotti. Una soppressione genica più stabile può essere ottenuta somministrando siRNA negli embrioni di pulcino mediante un sistema di retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) con un accettore di plice S)⁶. Il vettore virale si integra nel genoma dell’ospite e i geni ectopici sono espressi in modo stabile. Tuttavia, il retrovirus può integrarsi nel genoma delle cellule in divisione solo durante la fase mitotica (M) del ciclo cellulare, il che può imporre una limitazione agli stadi di sviluppo e/o ai tipi di cellule per i quali questo approccio di perdita di funzione può essere applicato. Inoltre, l’espressione dei transgeni da parte di RCAS appare più lenta e meno robusta di quella indotta dall’elettroporazione in ovo ⁷.

I trasposoni sono elementi genetici che si spostano da una posizione all’altra del genoma. L’elemento Tol2 è un membro della famiglia degli elementi trasponibili hAT e contiene un gene interno che codifica per una trasposasi che catalizza la reazione del trasposone dell’elemento Tol2⁸. Quando un vettore plasmidico che trasporta una cassetta di espressione genica affiancata dalle sequenze delle estremità sinistra e destra degli elementi Tol2 (200 bp e 150 bp, rispettivamente) viene introdotto in cellule di vertebrati con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2, la cassetta di espressione viene asportata dal plasmide e integrata nel genoma dell’ospite, che supporta un’espressione stabile del gene ectopico (Figura 1). È stato dimostrato che l’elemento trasponibile Tol2 può indurre la trasposizione genica in modo molto efficiente in diverse specie di vertebrati, tra cui il pesce zebra^9,10, le rane 11, i pulcini¹² e i topi ^13, ed è quindi un utile metodo di transgenesi e mutagenesi inserzionale. Il sistema di trasposoni Tol2 è stato utilizzato con successo per il knockdown condizionale di un gene bersaglio mediante integrazione genomica di siRNA che viene processato da RNA¹⁴ a doppio filamento lungo.

Questo protocollo descrive un approccio di perdita di funzione nell’embrione di pulcino che prevede l’introduzione di microRNA artificiali (miRNA) da parte del sistema di trasposone Tol2^15,16. In questo approccio, una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene clonata in un vettore di trasposone Tol2. Il costrutto del trasposone Tol2 viene quindi introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo. Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l’escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell’ospite, portando all’espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nei nostri studi precedenti, abbiamo abbattuto con successo l’espressione di Nel, una glicoproteina extracellulare espressa prevalentemente nel sistema nervoso, nella retina del pulcino in via di sviluppo (vedi Risultati rappresentativi). I nostri risultati indicano che la soppressione genica stabile ed efficiente può essere ottenuta in ovo con questa tecnica.