Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

La rétine des vertébrés est un système modèle important pour l’étude du développement neuronal. Malgré son emplacement périphérique, la rétine est anatomiquement et développementalement une extension du système nerveux central, et le nerf optique, qui se compose d’axones de cellules ganglionnaires rétiniennes, représente un tractus dans le système nerveux central. La rétine du poussin présente des avantages significatifs en tant que système modèle pour étudier le mécanisme moléculaire du développement neuronal : elle est grande et se développe rapidement ; il présente des similitudes structurelles et fonctionnelles avec la rétine humaine ; Il est très accessible pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Les mécanismes moléculaires de la prolifération et de la différenciation cellulaires, de la morphogenèse et du guidage axonale au cours du développement neuronal ont été largement étudiés à l’aide de la rétine de poulet.

L’électroporation in ovo a été utilisée avec succès au cours des deux dernières décennies pour introduire des gènes ectopiques dans les cellules de l’embryon de poussin en développement. Cette technique permet de marquer les cellules en développement, de tracer le destin cellulaire et de tracer la migration cellulaire et les voies axonales, ainsi que l’expression ectopique des gènes pour l’analyse in vivo de la fonction des gènes. Les conditions de l’électroporation in ovo pour une expression ectopique efficace des gènes chez les embryons de poussins ont été bien établies ^1,2,3.

Malgré ces avantages, l’absence d’une technique stable de perte de fonction pour l’étude de la fonction des gènes a été une limitation technique majeure de l’embryon de poussin. Alors que les embryons de poussins électroporés avec de petits ARN interférents (siRNAs)⁴ ou des vecteurs d’expression pour les ARN courts en épingle à cheveux (shRNAs)⁵ montrent l’inactivation du gène ciblé, la suppression des gènes dans ces approches est transitoire car les effets disparaissent une fois que les cellules perdent les ARN ou les ADN introduits. Une suppression génique plus stable peut être obtenue en délivrant des siRNA dans des embryons de poussin par un système rétrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)⁶. Le vecteur viral s’intègre dans le génome de l’hôte et les gènes ectopiques sont exprimés de manière stable. Cependant, le rétrovirus ne peut s’intégrer dans le génome des cellules en division que pendant la phase mitotique (M) du cycle cellulaire, ce qui peut imposer une limitation sur les stades de développement et/ou les types de cellules pour lesquels cette approche de perte de fonction peut être appliquée. De plus, l’expression des transgènes par RCAS apparaît plus lente et moins robuste que celle induite par l’électroporation in ovo ⁷.

Les transposons sont des éléments génétiques qui se déplacent d’un endroit à un autre du génome. L’élément Tol2 fait partie de la famille des éléments transposables hAT et contient un gène interne codant pour une transposase qui catalyse la réaction de transposon de^{l’élément 8} de Tol2. Lorsqu’un vecteur plasmidique porteur d’une cassette d’expression génique flanquée des séquences des extrémités gauche et droite des éléments Tol2 (200 pb et 150 pb, respectivement) est introduit dans des cellules de vertébrés avec une construction d’expression de la transposase Tol2, la cassette d’expression est excisée du plasmide et intégrée dans le génome de l’hôte, ce qui favorise une expression stable du gène ectopique (Figure 1). Il a été démontré que l’élément transposable Tol2 peut induire la transposition de gènes de manière très efficace chez différentes espèces de vertébrés, y compris le poisson-zèbre^9,10, les grenouilles 11, les poussins 12 et les souris ^13, et constitue donc une méthode utile de transgénèse et de mutagenèse insertionnelle. Le système de transposons Tol2 a été utilisé avec succès pour l’inactivation conditionnelle d’un gène cible par intégration génomique de siRNA qui est traité à partir d’un long ARN double brin¹⁴.

Ce protocole décrit une approche de perte de fonction dans l’embryon de poussin qui implique l’introduction de microARN artificiels (miARN) par le système de transposons Tol2^15,16. Dans cette approche, une cassette d’expression du marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des miARN artificiels contre un gène cible est clonée dans un vecteur transposon Tol2. La construction du transposon Tol2 est ensuite introduite dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo. Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans nos études précédentes, nous avons réussi à inhiber l’expression de Nel, une glycoprotéine extracellulaire principalement exprimée dans le système nerveux, dans la rétine du poussin en développement (voir Résultats représentatifs). Nos résultats indiquent qu’une suppression génique stable et efficace peut être obtenue in ovo par cette technique.