Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı
Summary
İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.
Abstract
Civciv retinası, büyük boyutu, hızlı gelişimi ve görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için erişilebilirliği gibi avantajları ile gelişimsel nörobiyolojide uzun zamandır önemli bir model sistem olmuştur. Bununla birlikte, en büyük teknik sınırlaması, gen fonksiyon analizleri için sağlam fonksiyon kaybı yaklaşımlarının olmamasıydı. Bu protokol, Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikroRNA’ların (miRNA’lar) transgenik ekspresyonunu içeren, gelişmekte olan civciv retinasında bir gen susturma metodolojisini açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) markörü için bir ekspresyon kaseti ve bir hedef gene karşı yapay pre-miRNA dizileri içeren bir Tol2 transpozon plazmidi, in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA’ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Daha önceki çalışmamızda, nöral gelişimde birden fazla işlevi yerine getiren bir glikoprotein olan Nel’in ekspresyonunun bu tekniği kullanarak gelişmekte olan civciv retinasında önemli ölçüde baskılanabileceğini göstermiştik. Sonuçlarımız, bu metodolojinin gen ekspresyonunun kararlı ve sağlam bir şekilde baskılanmasına neden olduğunu ve böylece retina gelişimi çalışmaları için etkili bir fonksiyon kaybı yaklaşımı sağladığını göstermektedir.
Introduction
Omurgalı retinası, nöral gelişimi incelemek için önemli bir model sistemdir. Periferik konumuna rağmen, retina anatomik ve gelişimsel olarak merkezi sinir sisteminin bir uzantısıdır ve retina ganglion hücrelerinin aksonlarından oluşan optik sinir, merkezi sinir sistemi içindeki bir yolu temsil eder. Civciv retinası, nöral gelişimin moleküler mekanizmasını incelemek için bir model sistem olarak önemli avantajlara sahiptir: Büyüktür ve hızla gelişir; İnsan retinası ile yapısal ve işlevsel benzerlikleri vardır; Görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için son derece erişilebilirdir. Nöral gelişim sırasında hücre proliferasyonu ve farklılaşması, morfogenez ve akson rehberliğinin moleküler mekanizmaları, tavuk retinası kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
In ovo elektroporasyon, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere ektopik genleri sokmak için son yirmi yılda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, gelişmekte olan hücrelerin etiketlenmesine, hücre kaderinin izlenmesine ve hücre göçü ve akson yollarının izlenmesine ve ayrıca gen fonksiyonunun in vivo analizi için ektopik gen ekspresyonuna izin verir. Civciv embriyolarında etkili ektopik gen ekspresyonu için in ovo elektroporasyonun koşulları iyi belirlenmiştir 1,2,3.
Bu avantajlara rağmen, gen fonksiyonu çalışmaları için kararlı bir fonksiyon kaybı tekniğinin olmaması, civciv embriyosunun önemli bir teknik sınırlaması olmuştur. Küçük enterferans yapan RNA’lar (siRNA’lar)4 veya kısa firkete RNA’ları (shRNA’lar) için ekspresyon vektörleri5 ile elektroporasyonlu civciv embriyoları, hedeflenen genin yıkıldığını gösterirken, bu yaklaşımlarda gen baskılanması geçicidir, çünkü hücreler eklenen RNA’ları veya DNA’ları kaybettiğinde etkiler ortadan kalkar. SiRNA’ların bir RCAS (Replication Copetent Avian sarkom-lökoz virüsü (ASLV) uzun terminal tekrarı (LTR) ile bir Splice alıcısı ile civciv embriyolarına verilmesiyle daha kararlı bir gen baskılanması sağlanabilir6. Viral vektör, konakçı genomuna entegre olur ve ektopik genler kararlı bir şekilde eksprese edilir. Bununla birlikte, retrovirüs yalnızca hücre döngüsünün mitotik (M) fazı sırasında bölünen hücrelerin genomuna entegre olabilir, bu da bu işlev kaybı yaklaşımının uygulanabileceği gelişim aşamaları ve/veya hücre tipleri üzerinde bir sınırlama getirebilir. Ek olarak, transgenlerin RCAS tarafından ekspresyonu, in ovo elektroporasyon7 tarafından indüklenenden daha yavaş ve daha az sağlam görünmektedir.
Transpozonlar, genom üzerinde bir konumdan diğerine hareket eden genetik elementlerdir. Tol2 elementi, hAT transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesidir ve Tol2 elementi8’in transpozon reaksiyonunu katalize eden bir transpozazı kodlayan dahili bir gen içerir. Tol2 elementlerinin sol ve sağ uçlarının dizileri (sırasıyla 200 bp ve 150 bp) ile çevrili bir gen ekspresyon kaseti taşıyan bir plazmit vektörü, bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısına sahip omurgalı hücrelerine sokulduğunda, ekspresyon kaseti plazmitten çıkarılır ve ektopik genin kararlı bir ekspresyonunu destekleyen konakçı genomuna entegre edilir (Şekil 1). Tol2 transpoze elementinin, zebra balığı 9,10, kurbağalar11, civcivler 12 ve fareler 13 dahil olmak üzere farklı omurgalı türlerinde gen transpozisyonunu çok verimli bir şekilde indükleyebildiği ve bu nedenle yararlı bir transgenez ve insersiyonel mutajenez yöntemi olduğu gösterilmiştir. Tol2 transpozon sistemi, uzun çift sarmallı RNA14’ten işlenen siRNA’nın genomik entegrasyonu ile bir hedef genin koşullu yıkımı için başarıyla kullanılmıştır.
Bu protokol, civciv embriyosunda Tol2 transpozon sistemi15,16 tarafından yapay mikroRNA’ların (miRNA’lar) eklenmesini içeren bir fonksiyon kaybı yaklaşımını açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) belirteci ve bir hedef gene karşı yapay miRNA’lar için bir ekspresyon kaseti, bir Tol2 transpozon vektörüne klonlanır. Tol2 transpozon yapısı daha sonra in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA’ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Önceki çalışmalarımızda, gelişmekte olan civciv retinasında, ağırlıklı olarak sinir sisteminde eksprese edilen hücre dışı bir glikoprotein olan Nel’in ekspresyonunu başarıyla düşürdük (bkz. Sonuçlarımız, bu teknikle ovoda stabil ve etkili gen baskılanmasının sağlanabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, in ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemi kullanılarak yapay miRNA’ların transgenik ekspresyonu ile gelişmekte olan civciv retinasında gen susturma için ayrıntılı bir kılavuz sağlar.
Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanmasında aşağıdaki faktörler kritik öneme sahiptir. İlk olarak, sağlam yıkım etkileri uyguladığı onaylanan miRNA dizilerini kullanmak çok önemlidir. Bunları in ovo elektroporasyon için uygulamadan önce, <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pT2K-CAGGS ve pCAGGS-T2TP vektörleri sırasıyla Yoshiko Takahashi (Kyoto Üniversitesi, Kyoto, Japonya) ve Koichi Kawakami (Ulusal Genetik Enstitüsü, Mishima, Japonya) tarafından sağlanmıştır. Michael Berberoğlu’na makaleyi çok önemli bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Royal Society ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi’nden (BBSRC) (İngiltere) MN’ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
