Подход с потерей функции в сетчатке эмбриона цыпленка с использованием транспозон-опосредованной тол2-транспозон-опосредованной экспрессии искусственных микроРНК

Сетчатка позвоночных является важной модельной системой для изучения развития нервной системы. Несмотря на периферическое расположение, сетчатка анатомически и эволюционно является продолжением центральной нервной системы, а зрительный нерв, состоящий из аксонов ганглиозных клеток сетчатки, представляет собой тракт в центральной нервной системе. Сетчатка цыпленка имеет существенные преимущества в качестве модельной системы для изучения молекулярного механизма развития нервов: она крупная и быстро развивается; она имеет структурное и функциональное сходство с сетчаткой человека; Он легко доступен для визуализации и экспериментальных манипуляций. Молекулярные механизмы пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза и управления аксонами во время развития нейронов были широко изучены с использованием сетчатки курицы.

Электропорация in ovo успешно используется в течение последних двух десятилетий для введения эктопических генов в клетки развивающегося эмбриона цыпленка. Этот метод позволяет мечить развивающиеся клетки, отслеживать судьбу клеток, отслеживать миграцию клеток и тракты аксонов, а также экспрессию эктопических генов для анализа функции генов in vivo. Хорошо установлены условия in ovo электропорации для эффективной экспрессии эктопических генов в куриных эмбрионах ^1,2,3.

Несмотря на эти преимущества, отсутствие стабильного метода потери функции для изучения функции генов было основным техническим ограничением эмбриона цыпленка. В то время как эмбрионы цыплят, электропорированные малыми интерферирующими РНК (миРНК)⁴ или векторами экспрессии для коротких шпильчатых РНК (шРНК)⁵, демонстрируют нокдаун гена-мишени, подавление генов в этих подходах является временным, поскольку эффекты исчезают, как только клетки теряют введенные РНК или ДНК. Более стабильная подавление генов может быть достигнута путем доставки миРНК в эмбрионы цыплят с помощью ретровирусной^{системы} RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) с длинным терминальным повтором (LTR) с акцептором S-plice). Вирусный вектор встраивается в геном хозяина, и эктопические гены стабильно экспрессируются. Тем не менее, ретровирус может интегрироваться в геном делящихся клеток только во время митотической (М) фазы клеточного цикла, что может наложить ограничения на стадии развития и/или типы клеток, для которых может быть применен этот подход с потерей функции. Кроме того, экспрессия трансгенов RCAS оказывается более медленной и менее устойчивой, чем экспрессия, индуцированная in ovo electroporation⁷.

Транспозоны — это генетические элементы, которые перемещаются из одного места генома в другое. Элемент Tol2 является членом семейства транспозируемых элементов hAT и содержит внутренний ген, кодирующий транспозазу, которая катализирует транспозонную реакцию элемента Tol2⁸. Когда плазмидный вектор, несущий кассету экспрессии гена, окруженную последовательностями левого и правого концов элементов Tol2 (200.н. и 150.н., соответственно), вводится в клетки позвоночных с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2, экспрессионная кассета вырезается из плазмиды и интегрируется в геном хозяина, что поддерживает стабильную экспрессию эктопического гена (рис.). Было показано, что транспозируемый элемент Tol2 может очень эффективно индуцировать транспозицию генов у различных видов позвоночных, включая рыбок данио-рерио^9,10, лягушек 11, цыплят 12 и мышей ¹³, и, таким образом^, является полезным методом трансгенеза и инсерционного мутагенеза. Транспозонная система Tol2 была успешно использована для условного нокдауна гена-мишени путем геномной интеграции миРНК, обработанной из длинной двухцепочечной РНК¹⁴.

Этот протокол описывает подход с потерей функции у эмбриона цыпленка, который включает введение искусственных микроРНК (микроРНК) с помощью транспозонной системы Tol2^15,16. В этом подходе экспрессионная кассета для маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственных микроРНК против гена-мишени клонируется в транспозонный вектор Tol2. Затем транспозонная конструкция Tol2 вводится в эмбриональную сетчатку цыпленка с конструкцией экспрессии Tol2 транспозазы путем электропорации in ovo. В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В наших предыдущих исследованиях мы успешно сбивали экспрессию Nel, внеклеточного гликопротеина, преимущественно экспрессируемого в нервной системе, в развивающейся сетчатке цыпленка (см. Репрезентативные результаты). Наши результаты показывают, что стабильная и эффективная подавление генов может быть достигнута in ovo с помощью этого метода.