גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי
Summary
פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ”א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.
Abstract
רשתית האפרוחים היא כבר מזמן מערכת מודל חשובה בנוירוביולוגיה התפתחותית, עם יתרונות הכוללים את גודלה הגדול, התפתחותה המהירה ונגישותה להדמיה ולמניפולציות ניסיוניות. עם זאת, המגבלה הטכנית העיקרית שלה הייתה היעדר גישות חזקות לאובדן תפקוד עבור ניתוח תפקודי גנים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה של השתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת הכוללת ביטוי מהונדס של מיקרו-רנ”א מלאכותי (miRNAs) באמצעות מערכת טרנספוזון Tol2. בגישה זו, פלסמיד טרנספוזון Tol2 המכיל קלטת ביטוי לסמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ורצפי קדם-miRNA מלאכותיים כנגד גן מטרה מוכנס לרשתית האפרוח העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו . בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקר הקודם שלנו, הראינו כי הביטוי של Nel, גליקופרוטאין המפעיל פונקציות מרובות בהתפתחות עצבית, יכול להיות מדוכא באופן משמעותי ברשתית אפרוח מתפתחת באמצעות טכניקה זו. התוצאות שלנו מצביעות על כך שמתודולוגיה זו גורמת לדיכוי יציב וחזק של ביטוי גנים ובכך מספקת גישה יעילה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית.
Introduction
רשתית בעלי החוליות היא מערכת מודל חשובה לחקר התפתחות עצבית. למרות מיקומה ההיקפי, הרשתית היא שלוחה אנטומית והתפתחותית של מערכת העצבים המרכזית, ועצב הראייה, המורכב מאקסונים של תאי גנגליון ברשתית, מייצג מערכת בתוך מערכת העצבים המרכזית. לרשתית האפרוחים יתרונות משמעותיים כמערכת מודל לחקר המנגנון המולקולרי של ההתפתחות העצבית: היא גדולה ומתפתחת במהירות; יש לו דמיון מבני ופונקציונלי לרשתית האנושית; הוא נגיש מאוד עבור ויזואליזציה ומניפולציות ניסיוניות. מנגנונים מולקולריים של התרבות תאים והתמיינותם, מורפוגנזה והנחיית אקסונים במהלך ההתפתחות העצבית נחקרו בהרחבה באמצעות רשתית העוף.
בשני העשורים האחרונים נעשה שימוש מוצלח באלקטרופורציה כדי להחדיר גנים חוץ רחמיים לתאים בעובר האפרוח המתפתח. טכניקה זו מאפשרת תיוג של תאים מתפתחים, מעקב אחר גורל התא ומעקב אחר נדידת תאים ודרכי אקסונים, כמו גם ביטוי גנים חוץ רחמי לניתוח in vivo של תפקוד גנים. התנאים של אלקטרופורציה לביטוי גנים חוץ רחמי יעיל בעוברי אפרוחים נקבעו היטב 1,2,3.
למרות יתרונות אלה, היעדר טכניקת אובדן תפקוד יציבה למחקרים על תפקוד גנים היה מגבלה טכנית משמעותית של עובר האפרוח. בעוד שעוברי אפרוחים שהתחשמלו באמצעות רנ”א מפריע קטן (siRNAs)4 או וקטורי ביטוי לרנ”א קצר סיכת שיער (shRNAs)5 מראים הפלה של גן המטרה, דיכוי גנים בגישות אלה הוא חולף מכיוון שההשפעות נעלמות ברגע שהתאים מאבדים את הרנ”א או הדנ”א שהוכנסו. דיכוי גנים יציב יותר יכול להיות מושג על ידי העברת siRNA לעוברי אפרוחים על ידי RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem 6. הווקטור הנגיפי משתלב בגנום המארח, והגנים החוץ-רחמיים באים לידי ביטוי יציב. עם זאת, הרטרו-וירוס יכול להשתלב בגנום של תאים מתחלקים רק בשלב המיטוטי (M) של מחזור התא, מה שעשוי להטיל מגבלה על שלבי ההתפתחות ו / או סוגי התאים שעבורם ניתן ליישם גישה זו של אובדן תפקוד. בנוסף, ביטוי טרנסגנים על ידי RCAS נראה איטי יותר ופחות חזק מזה המושרה על ידי אלקטרופורציה7.
טרנספוזונים הם אלמנטים גנטיים הנעים ממקום אחד בגנום למשנהו. אלמנט Tol2 הוא חבר במשפחת האלמנטים הניתנים לטרנספוזון hAT ומכיל גן פנימי המקודד טרנספוזאז המזרז את תגובת הטרנספוזוןשל אלמנט Tol2 8. כאשר וקטור פלסמיד הנושא קלטת ביטוי גנים שמשני צדדיה רצפים של הקצה השמאלי והימני של יסודות Tol2 (200 bp ו-150 bp, בהתאמה) מוכנס לתאי חוליות עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2, קלטת הביטוי נכרתת מהפלסמיד ומשולבת בגנום המארח, אשר תומך בביטוי יציב של הגן החוץ רחמי (איור 1). הוכח כי היסוד הטרנספוזי Tol2 יכול לגרום לטרנספוזיציה גנטית ביעילות רבה במינים שונים של בעלי חוליות, כולל דגי זברה9,10, צפרדעים 11, אפרוחים 12 ועכברים 13, ולכן הוא שיטה שימושית של טרנסגנזה ומוטגנזה החדרתית. מערכת הטרנספוזון Tol2 שימשה בהצלחה להפלה מותנית של גן מטרה על ידי אינטגרציה גנומית של siRNA המעובד מ-RNA דו-גדילי ארוך14.
פרוטוקול זה מתאר גישת אובדן תפקוד בעובר אפרוח הכוללת החדרת מיקרו-רנ”א מלאכותי (miRNAs) על ידי מערכת טרנספוזון Tol215,16. בגישה זו, קלטת ביטוי עבור סמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ו- miRNA מלאכותי כנגד גן מטרה משובטת לווקטור טרנספוזון Tol2. לאחר מכן מכניסים את מבנה הטרנספוזון Tol2 לרשתית הגוזל העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזון Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו. בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקרים הקודמים שלנו, הצלחנו להפיל את הביטוי של Nel, גליקופרוטאין חוץ-תאי המתבטא בעיקר במערכת העצבים, ברשתית האפרוח המתפתחת (ראו תוצאות מייצגות). התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להשיג דיכוי גנים יציב ויעיל באמצעות טכניקה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט להשתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת על ידי ביטוי מהונדס של miRNA מלאכותי באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2.
הגורמים הבאים הם בעלי חשיבות קריטית בביצוע טכניקה זו בהצלחה. ראשית, קריטי להשתמש ברצפי miRNA שאושרו כבעלי השפעות חזקות של הפלה. ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הווקטורים pT2K-CAGGS ו-pCAGGS-T2TP סופקו באדיבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן) וקואיצ’י קוואקאמי (המכון הלאומי לגנטיקה, מישימה, יפן), בהתאמה. אנו מודים למיכאל ברברוגלו על קריאתו המכרעת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהחברה המלכותית ומועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC) (בריטניה) ל- M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
