Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile
Summary
Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.
Abstract
Le specie di micobatteri possono differire l’una dall’altra nel tasso di crescita, nella presenza di pigmentazione, nella morfologia della colonia visualizzata su mezzi solidi e in altre caratteristiche fenotipiche. Tuttavia, tutti hanno in comune il carattere più rilevante dei micobatteri: la sua parete cellulare unica e altamente idrofoba. Le specie di micobatteri contengono un complesso legato alla membrana-covalente che include arabinogalattano, peptidoglicano e lunghe catene di acidi micolici con tipi che differiscono tra le specie di micobatteri. Inoltre, i micobatteri possono anche produrre lipidi che si trovano, non legati covalentemente, sulle loro superfici cellulari, come i dimicoceroti di policomerosati (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), glicopeptidolipidi (GPL), acilmalosi (AT) o mannosidi fosfatidi-inositolo (PIM), tra gli altri. Alcuni di essi sono considerati fattori di virulenza nei micobatteri patogeni o lipidi antigenici critici nell’interazione ospite-micobatteri. Per questi motivi, c’è un notevole interesse nello studio dei lipidi micobatterici a causa della loro applicazione in diversi campi, dalla comprensione del loro ruolo nella patogenicità delle infezioni da micobatteri, a una possibile implicazione come agenti immunomodulatori per il trattamento di malattie infettive e altre patologie come il cancro. Qui, viene presentato un semplice approccio per estrarre e analizzare il contenuto lipidico totale e la composizione dell’acido micolico delle cellule di micobatteri coltivate in un mezzo solido utilizzando miscele di solventi organici. Una volta ottenuti gli estratti lipidici, viene eseguita la cromatografia a strato sottile (TLC) per monitorare i composti estratti. L’esperimento di esempio viene eseguito con quattro diversi micobatteri: il Mycolicibacterium brumae e il Mycolicibacterium fortuitum a crescita lenta attenuati, il Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) a crescita rapida e il patogeno opportunistico a crescita rapida Mycobacterium abscessus, dimostrando che i metodi mostrati nel presente protocollo possono essere utilizzati per una vasta gamma di micobatteri.
Introduction
Mycobacterium è un genere che comprende specie patogene e non patogene, caratterizzate dall’avere una parete cellulare altamente idrofoba e impermeabile formata dai loro peculiari lipidi. In particolare, la parete cellulare micobatterica contiene acidi micolici, che sono acidi grassi α-alchilici e β-idrossi, in cui il ramo α è costante in tutti gli acidi micolici (ad eccezione della lunghezza) e la catena β, chiamata catena meromicolato, è una lunga catena alifatica che può contenere diversi gruppi chimici funzionali descritti insieme alla letteratura (α-, α’-, metossi-, κ-, epossidici, carbossi e ω-1-metossi-micolati), producendo quindi sette tipi di acidi micolici (I-VII)1. Inoltre, altri lipidi di indiscutibile importanza sono presenti anche nella parete cellulare delle specie di micobatteri. Specie patogene come Mycobacterium tuberculosis, l’agente eziologico della tubercolosi2 producono specifici fattori di virulenza a base lipidica come i dimicoceroti di polimicoceroti (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), di-, tri- e penta-acilmalefalosi (DAT, TAT e PAT), o sulfolipidi, tra gli altri3. La loro presenza sulla superficie micobatterica è stata associata alla capacità di modificare la risposta immunitaria dell’ospite e, quindi, all’evoluzione e alla persistenza del micobatterio all’interno dell’ospite4. Ad esempio, la presenza di triacilgliceroli (TAG) è stata associata al fenotipo ipervirulento del lignaggio 2-Pechino del lignaggio di M. tuberculosis, forse a causa della sua capacità di attenuare la risposta immunitaria dell’ospite5,6. Altri lipidi rilevanti sono i lipooligosaccaridi (LOS) presenti nei micobatteri tubercolari e non tubercolari. Nel caso di Mycobacterium marinum, la presenza di LOS nella sua parete cellulare è correlata alla motilità scorrevole e alla capacità di formare biofilm e interferisce con il riconoscimento da parte dei recettori di riconoscimento del pattern macrofagico, influenzando l’assorbimento e l’eliminazione dei batteri da parte dei fagociti ospiti7,8. Inoltre, l’assenza o la presenza di alcuni lipidi consente ai membri della stessa specie di essere classificati in diversi morfotipi con profili virulenti o attenuati quando interagiscono con le cellule ospiti. Ad esempio, l’assenza di glicopeptidolipidi (GPL) nel morfotipo grezzo di Mycobacterium abscessus è stato associato alla capacità di indurre acidificazione intrafagosomica, e di conseguenza apoptosi cellulare9, a differenza del morfotipo liscio che possiede GPL nella loro superficie. Inoltre, il contenuto lipidico della parete cellulare micobatterica è correlato alla capacità di modificare la risposta immunitaria nell’ospite. Questo è rilevante nel contesto dell’uso di alcuni micobatteri per innescare un profilo immunitario protettivo contro diverse patologie10,11,12,13. È stato dimostrato, ad esempio, che Mycolicibacterium vaccae, un micobatterio saprofita, che è attualmente in studi clinici di fase III come vaccino immunoterapeutico per la tubercolosi, mostra due morfotipi coloniali. Mentre il fenotipo liscio, che contiene un poliestere nella sua superficie, innesca una risposta Th2, il fenotipo ruvido privo del poliestere può indurre un profilo Th1 quando interagisce con le cellule immunitarie dell’ospite14. Il repertorio di lipidi presenti nella cellula micobatterica non dipende solo dalle specie di micobatteri, ma anche dalle condizioni delle colture micobatteriche: tempo di incubazione15,16 o composizione del terreno di coltura17,18. Infatti, i cambiamenti nella composizione del terreno di coltura influenzano l’attività antitumorale e immunostimolante di M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Inoltre, il profilo immunitario protettivo innescato da M. bovis BCG contro M. tuberculosis la sfida nei modelli di topi dipende anche dai mezzi di coltura in cui M. bovis BCG cresce17. Questi potrebbero quindi essere correlati alla composizione lipidica dei micobatteri in ogni condizione di coltura. Per tutti questi motivi, lo studio del contenuto lipidico dei micobatteri è rilevante. Viene presentata una procedura visiva per estrarre e analizzare la composizione lipidica della parete cellulare micobatterica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene presentato un semplice protocollo considerato come il metodo gold standard per l’estrazione di composti lipidici non legati in modo covalente dalla parete cellulare micobatterica. Viene mostrata un’ulteriore visualizzazione da parte di TLC mono e bidimensionali dai lipidi estratti di quattro diversi micobatteri.
Due miscele combinate consecutive di cloroformio e metanolo per recuperare il contenuto lipidico delle cellule micobatteriche è la miscela solvente più utilizzata<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero spagnolo della Scienza, dell’Innovazione e delle Università (RTI2018-098777-B-I00), dai Fondi FEDER e dalla Generalitat della Catalogna (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido è la destinataria di un contratto di dottorato (FI) presso la Generalitat de Catalunya.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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