Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie
Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.
Abstract
Mycobacteriënsoorten kunnen van elkaar verschillen in de groeisnelheid, aanwezigheid van pigmentatie, de koloniemorfologie weergegeven op vaste media, evenals andere fenotypische kenmerken. Ze hebben echter allemaal het meest relevante karakter van mycobacteriën gemeen: de unieke en zeer hydrofobe celwand. Mycobacteriën soorten bevatten een membraan-covalent gekoppeld complex dat arabinogalactan, peptidoglycan en lange ketens van mycolische zuren omvat met soorten die verschillen tussen mycobacteriën soorten. Bovendien kunnen mycobacteriën ook lipiden produceren die zich bevinden, niet-covalent gekoppeld, op hun celoppervlakken, zoals phthiocerol dimycocerosaten (PDIM), fenolglycoliden (PGL), glycopeptidolipiden (GPL), acyltrehalosen (AT) of fosfatidil-inositol mannosides (PIM), onder anderen. Sommigen van hen worden beschouwd als virulentiefactoren in pathogene mycobacteriën, of kritische antigene lipiden in gastheer-mycobacteriën interactie. Om deze redenen is er een aanzienlijke interesse in de studie van mycobacteriële lipiden vanwege hun toepassing op verschillende gebieden, van het begrijpen van hun rol in de pathogeniciteit van mycobacteriën-infecties, tot een mogelijke implicatie als immunomodulerende middelen voor de behandeling van infectieziekten en andere pathologieën zoals kanker. Hier wordt een eenvoudige benadering gepresenteerd om het totale lipidengehalte en de mycolzuursamenstelling van mycobacteriëncellen gekweekt in een vast medium met behulp van mengsels van organische oplosmiddelen te extraheren en te analyseren. Zodra de lipide-extracten zijn verkregen, wordt dunnelaagchromatografie (TLC) uitgevoerd om de geëxtraheerde verbindingen te controleren. Het voorbeeldexperiment wordt uitgevoerd met vier verschillende mycobacteriën: de in het milieu snelgroeiende Mycolicibacterium brumae en Mycolicibacterium fortuitum, de verzwakte langzaam groeiende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) en de opportunistische pathogeen snelgroeiende Mycobacterium abccessus, wat aantoont dat methoden die in het huidige protocol worden getoond, kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan mycobacteriën.
Introduction
Mycobacterium is een geslacht dat pathogene en niet-pathogene soorten omvat, gekenmerkt door een zeer hydrofobe en ondoordringbare celwand gevormd door hun eigenaardige lipiden. In het bijzonder bevat de mycobacteriële celwand mycolzuren, die α-alkyl- en β-hydroxy-vetzuren zijn, waarbij de α-tak constant is in alle mycolzuren (behalve de lengte) en de β-keten, de meromycoladeketen genoemd, een lange alifatische keten is die verschillende functionele chemische groepen kan bevatten die samen met de literatuur worden beschreven (α-, α’-, methoxy-, κ-, epoxy-, carboxy- en ω-1-methoxy-mycolaten), waardoor zeven soorten mycolzuren (I-VII) worden geproduceerd1. Bovendien zijn andere lipiden met onbetwistbaar belang ook aanwezig in de celwand van mycobacteriënsoorten. Pathogene soorten zoals Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose2 produceren specifieke lipide-gebaseerde virulentiefactoren zoals phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolglycollipide (PGL), di-, tri- en penta-acyltrehalosen (DAT, TAT en PAT), of sulfolipiden, onder anderen3. Hun aanwezigheid op het mycobacteriële oppervlak is in verband gebracht met het vermogen om de immuunrespons van de gastheer te wijzigen en daarom de evolutie en persistentie van de mycobacterium in de gastheer4. De aanwezigheid van triacylglycerolen (TAG) is bijvoorbeeld geassocieerd met het hypervirulente fenotype van lineage 2-Beijing sublijn van M. tuberculosis, mogelijk vanwege het vermogen om de immuunrespons van de gastheer te verzwakken5,6. Andere relevante lipiden zijn lipooligosacchariden (LOSs) die aanwezig zijn in tuberculeuze en niet-tuberculeuze mycobacteriën. In het geval van Mycobacterium marinum, de aanwezigheid van LOSs in de celwand is gerelateerd aan glijdende beweeglijkheid en het vermogen om biofilms te vormen en interfereert met herkenning door macrofaagpatroonherkenningsreceptoren, waardoor de opname en eliminatie van de bacteriën door gastheerfagocyten wordt beïnvloed7,8. Bovendien maakt de afwezigheid of aanwezigheid van sommige lipiden het mogelijk om leden van dezelfde soort in te delen in verschillende morfotypen met virulente of verzachtende profielen bij interactie met gastheercellen. Bijvoorbeeld de afwezigheid van glycopeptidolipiden (GPL) in het ruwe morfotype van Mycobacterium abscessus is in verband gebracht met het vermogen om intrafagosomale verzuring en bijgevolg celapoptose te induceren9, in tegenstelling tot het gladde morfotype dat GPL’s in hun oppervlak bezit. Bovendien is het lipidegehalte van de mycobacteriële celwand gerelateerd aan het vermogen om de immuunrespons in de gastheer te wijzigen. Dit is relevant in de context van het gebruik van sommige mycobacteriën om een beschermend immuunprofiel tegen verschillende pathologieën te activeren10,11,12,13. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat Mycolicibacterium vaccae, een saprofytische mycobacterie, die zich momenteel in fase III klinische studies bevindt als immunotherapeutisch vaccin voor tuberculose, vertoont twee koloniale morfotypen. Terwijl het gladde fenotype, dat een polyester in het oppervlak bevat, een Th2-respons veroorzaakt, kan het ruwe fenotype zonder polyester een Th1-profiel induceren wanneer het interageert met immuuncellen van de gastheer14. Het repertoire van lipiden aanwezig in de mycobacteriële cel hangt niet alleen af van mycobacteriënsoorten, maar ook van de omstandigheden van mycobacteriële culturen: incubatietijd15,16 of samenstelling van het kweekmedium17,18. In feite beïnvloeden veranderingen in de samenstelling van het kweekmedium de antitumor- en immunostimulerende activiteit van M. bovis BCG en Mycolicibacterium brumae in vitro17. Bovendien wordt het beschermende immuunprofiel veroorzaakt door M. bovis BCG tegen M. tuberculosis uitdaging in muizenmodellen hangt ook af van de cultuurmedia waarin M. bovis BCG groeit17. Deze kunnen dan worden gerelateerd aan de lipidesamenstelling van de mycobacteriën in elke kweekconditie. Om al deze redenen is de studie van het lipidengehalte van mycobacteriën relevant. Een visuele procedure om de lipidesamenstelling van de mycobacteriële celwand te extraheren en te analyseren, wordt gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een eenvoudig protocol dat wordt beschouwd als de gouden standaardmethode voor de extractie van niet-covalent gekoppelde lipideverbindingen uit de mycobacteriële celwand wordt gepresenteerd. Verdere visualisatie door een- en tweedimensionale TLC’s uit de geëxtraheerde lipiden van vier verschillende mycobacteriën wordt getoond.
Twee opeenvolgende gecombineerde mengsels van chloroform en methanol om het lipidegehalte van mycobacteriële cellen terug te winnen, is het meest gebruikte oplosmidd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten (RTI2018-098777-B-I00), de FEDER-fondsen en de Generalitat van Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido is de ontvanger van een PhD contract (FI) van de Generalitat de Catalunya.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
