Summary

İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Published: April 16, 2021
doi:

Summary

Çok çeşitli mikobakterilerin hücre duvarının toplam lipit içeriğini çıkarmak için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, farklı mikolik asit türlerinin ekstraksiyon ve analitik protokolleri gösterilmiştir. Bu mikobakteriyel bileşikleri izlemek için ince katmanlı bir kromatografik protokol de sağlanmaktadır.

Abstract

Mikobakteri türleri büyüme hızında, pigmentasyon varlığında, katı medyada görüntülenen koloni morfolojisinde ve diğer fenotipik özelliklerde birbirinden farklı olabilir. Bununla birlikte, hepsi mikobakterilerin en alakalı karakterine sahiptir: benzersiz ve son derece hidrofobik hücre duvarı. Mikobakteri türleri, mikobakteri türleri arasında farklılık gösteren türlere sahip arabinogalactan, peptidoglikan ve uzun mikolik asit zincirlerini içeren membran-kovalent bağlantılı bir kompleks içerir. Ek olarak, mikobakteriler ayrıca bulunan lipitleri de üretebilir, phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipidler (PGL), glikoptidolipidler (GPL), acyltrehaloses (AT) veya fosfatidil-inositol mannosides (PIM) gibi hücre yüzeylerinde, yaygın olarak bağlı değildir. Bazıları patojenik mikobakterilerde virülans faktörleri veya konak-mikobakteri etkileşiminde kritik antijenik lipitler olarak kabul edilir. Bu nedenlerle mikobakteriyel lipitlerin mikobakteri enfeksiyonlarının patojenikliğindeki rollerini anlamalarından, bulaşıcı hastalıkların ve kanser gibi diğer patolojilerin tedavisinde immünomodülatör ajanlar olarak olası bir imaya kadar çeşitli alanlarda uygulanması nedeniyle incelenmesine önemli bir ilgi vardır. Burada, organik çözücülerin karışımları kullanılarak katı bir ortamda yetiştirilen mikobakteri hücrelerinin toplam lipit içeriğini ve mikolik asit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için basit bir yaklaşım sunulmaktadır. Lipit özleri elde edildikten sonra, çıkarılan bileşikleri izlemek için ince tabaka kromatografisi (TLC) yapılır. Örnek deney dört farklı mikobakteri ile gerçekleştirilir: çevresel hızlı büyüyen Mycolicibacterium brumae ve Mycolicibacterium fortuitum, zayıflamış yavaş büyüyen Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) ve fırsatçı patojen hızlı büyüyen Mycobacterium apsesi, mevcut protokolde gösterilen yöntemlerin çok çeşitli mikobakteriler için kullanılabileceğini göstermiştir.

Introduction

Mycobacterium patojenik ve patojenik olmayan türlerden oluşan bir cinstir, kendine özgü lipitleri tarafından oluşturulan son derece hidrofobik ve geçirimsiz bir hücre duvarına sahip olması ile karakterizedir. Özellikle, mikobakteri hücre duvarı mikolik asitler içerir, tüm mikolik asitlerde (uzunluk hariç) α dalının sabit olduğu α-alkil ve β-hidroksi yağ asitleri olan ve meromycolate zinciri olarak adlandırılan β zinciri, literatürle birlikte tanımlanan farklı fonksiyonel kimyasal grupları içerebilen uzun bir alifatik zincirdir (α, α’, metoksi-, φ-, epoksi-, karboksi-ve ω-1-metoksi- mikolatlar), bu nedenle yedi tür mikolik asit üretir (I-VII)1. Ayrıca, mikobakteri türlerinin hücre duvarında tartışmasız öneme sahip diğer lipitler de mevcuttur. Patojenik türler gibi Mycobacterium tuberculosis, tüberkülozun etken maddesi2 phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipid (PGL), di,tri-ve penta-acyltrehaloses (DAT, TAT ve PAT) veya sulfolipids gibi spesifik lipid bazlı virülans faktörleri üretir3. Mikobakteri yüzeyindeki varlıkları, konak immün yanıtı değiştirme yeteneği ve bu nedenle konakçı içindeki mikobakterinin evrimi ve kalıcılığı ile ilişkilendirilmiştir.4. Örneğin, triacylglycerols (TAG) varlığı Lineage 2-Pekin alt soy hipervirulent fenotip ile ilişkilendirilmiştir M. tuberculosis, muhtemelen konak bağışıklık tepkisini zayıflatıcı kapasitesi nedeniyle5,6. Diğer ilgili lipitler tüberküloz ve nontuberculous mikobakterilerde bulunan lipooligosaccharides (LOSs) ‘dir. Durumunda Mycobacterium marinum, HÜCRE DUVARINDA LOSS’un varlığı sürgü hareketliliği ve biyofilm oluşturma yeteneği ile ilgilidir ve makrofaj örüntü tanıma reseptörleri tarafından tanınmasına müdahale eder, konak fagositler tarafından bakterilerin alımını ve yok olmasını etkiler7,8. Ek olarak, bazı lipitlerin yokluğu veya varlığı, aynı türün üyelerinin konak hücrelerle etkileşime girerken virülan veya zayıf profillere sahip farklı morfotipler halinde sınıflandırılmasına izin verir. Örneğin, kaba morfotipinde glikopeptidolipidlerin (GPL) bulunmaması Mycobacterium abscessus intrafagozomal asitleşmeye ve dolayısıyla hücre apoptozuna neden olma yeteneği ile ilişkilendirilmiştir.9, yüzeylerinde GPL’lere sahip pürüzsüz morfotipin aksine. Ayrıca, mikobakteri hücre duvarının lipit içeriği konakçıda immün yanıtı değiştirme yeteneği ile ilgilidir. Bu, farklı patolojilere karşı koruyucu bir bağışıklık profilini tetiklemek için bazı mikobakterilerin kullanılması bağlamında geçerlidir.10,11,12,13Örneğin, Mycolicibacterium vaccae, şu anda tüberküloz için immünoterapik bir aşı olarak faz III klinik çalışmalarda bulunan bir saprofitik mikobakteri, iki kolonyal morfotip gösterir. Yüzeyinde bir polyester içeren pürüzsüz fenotip bir Th2 yanıtını tetiklerken, polyesterden yoksun kaba fenotip, konak bağışıklık hücreleriyle etkileşime girdiğinde bir Th1 profiline neden olabilir.14. Mikobakteri hücresinde bulunan lipitlerin repertuarı sadece mikobakteri türlerine değil, aynı zamanda mikobakteri kültürlerinin koşullarına da bağlıdır: kuluçka zamanı15,16 veya kültür ortamının bileşimi17,18. Aslında, kültür orta bileşimindeki değişiklikler antitümör ve immünostimülatör aktivitesini etkiler. M. bovis BCG ve Mycolicibacterium brumae in vitro17. Ayrıca, tarafından tetiklenen koruyucu bağışıklık profili M. bovis BCG karşı M. tuberculosis fare modellerinde meydan okuma, aynı zamanda M. bovis BCG büyüyor17. Bunlar daha sonra her kültür durumunda mikobakterilerin lipid bileşimi ile ilgili olabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı, mikobakterilerin lipit içeriğinin incelenmesi önemlidir. Mikobakteri hücre duvarının lipit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için görsel bir prosedür sunulmuştur.

Protocol

1. Toplam kovalent bağlantılı olmayan lipitlerin mikobakterilerden çıkarılması (Şekil 1) Katı bir ortamdan 0,2 g mikobakteri çizin ve politetrafloroetilen (PTFE) astar vidalı kapaklı bir cam tüpe ekleyin. 5 mL kloroform ve 10 mL metanolden oluşan bir çözelti ekleyin (kloroform:metanol, 1:2).NOT: Organik çözücüler kullanıldığında sadece cam alıcı kullanılmalıdır. Plastik kaplara izin verilmez. Ayrıca, şişeler için PTFE astar vidalı kapaklara iht…

Representative Results

Farklı mikobakteri türlerinde bulunan çok çeşitli lipitleri göstermek amacıyla, Pürüzlü ve yavaş büyüyen mikobakteriler olduğu için M. bovis BCG seçildi. Prosedüre kaba ve hızlı büyüyen M. fortuitum ve M. brumae eklendi ve son olarak M. apsesinin pürüzsüz morfotipine de yer verildi. Bu dört tür, akiltrehalozlar (AT), GPL’ler, PDIM, PGL, PIM, TDM ve TMM gibi mikobakterilerden türetilmiş geniş bir lipit spektrumunu görselleştirmemize izin verir. Ayrıca, d?…

Discussion

Mikobakteri hücre duvarından yaygın olarak bağlı olmayan lipit bileşiklerinin çıkarılması için altın standart yöntem olarak kabul edilen basit bir protokol sunulmuştur. Dört farklı mikobakterinin çıkarılan lipitlerinden bir ve iki boyutlu TLC’ler tarafından daha fazla görselleştirme gösterilmiştir.

Mikobakteri hücrelerinin lipidik içeriğini kurtarmak için art arda iki kombine kloroform ve metanol karışımı en yaygın kullanılan çözücü karışımıdır<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma İspanya Bilim, Yenilik ve Üniversiteler Bakanlığı (RTI2018-098777-B-I00), FEDER Fonları ve Catalunya Generalitat (2017SGR-229) tarafından finanse edildi. Sandra Guallar-Garrido, Generalitat de Catalunya’dan bir doktora sözleşmesinin (FI) sahibidir.

Materials

Acetic Acid Merck 100063 CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Acetone Carlo Erba 400971N CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
Anthrone Merck 8014610010 Anthrone for synthesis.
Benzene Carlo Erba 426113 CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l
Capillary glass tube Merck BR708709 BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
Chloroform Carlo Erba 412653 CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heater J.P. Selecta 7471200
Dicloromethane Carlo Erba 412622 CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl ether Carlo Erba 412672 CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L
Ethyl Acetate Panreac 1313181211 CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol Absolute Carlo Erba 4146072 CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L
Glass funnel VidraFOC DURA.2133148 1217/1
Glass tube VidraFOC VFOC.45066A-16125 Glass tube with PTFE recovered cap
Methanol Carlo Erba 412722 CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrate Merck 51429-74-4 CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% Sigma M1942-100ML CAUTION.
n-hexane Carlo Erba 446903 CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylurea Sigma N4766 CAUTION
Orbital shaking platform DDBiolab 995018 NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC) Carlo Erba 427003 CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L
Sprayer VidraFOC 712/1
Sodium sulphate anhydrous Merck 238597
Sulfuric acid 95-97% Merck 1007311000 CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamber Merck Z204226-1EA Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plate Merck 1057210001 TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u
TLC Plate Heater CAMAG 223306 CAMAG TLC Plat Heater III
Toluene Carlo Erba 488551 CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L
Vortex Fisher Scientific 10132562 IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphthol Sigma-Aldrich 102269427 CAUTION.

References

  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).

Play Video

Cite This Article
Guallar-Garrido, S., Luquin, M., Julián, E. Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (170), e62368, doi:10.3791/62368 (2021).

View Video