Analyse der Lipidzusammensetzung von Mykobakterien mittels Dünnschichtchromatographie
Summary
Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.
Abstract
Mykobakterienarten können sich in der Wachstumsrate, dem Vorhandensein von Pigmentierung, der koloniemorphologischen Auf festen Medien sowie anderen phänotypischen Merkmalen voneinander unterscheiden. Sie alle haben jedoch den relevantesten Charakter von Mykobakterien gemeinsam: ihre einzigartige und hochhydrophobe Zellwand. Mykobakterien-Arten enthalten einen membrankovalenten Komplex, der Arabinogalactan, Peptidoglycan und lange Ketten von Mykolsäuren mit Typen umfasst, die sich zwischen mykobakterienarten unterscheiden. Darüber hinaus können Mykobakterien auch Lipide produzieren, die sich nicht kovalent auf ihren Zelloberflächen befinden, wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIM), phenolische Glykolipide (PGL), Glykopeptidolipide (GPL), Acyltrehalose (AT) oder Phosphatidil-Inositol-Mannosiside (PIM). Einige von ihnen gelten als Virulenzfaktoren in pathogenen Mykobakterien oder kritische antigene Lipide in der Wirt-Mykobakterien-Interaktion. Aus diesen Gründen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung von mykobakteriellen Lipiden aufgrund ihrer Anwendung in verschiedenen Bereichen, vom Verständnis ihrer Rolle bei der Pathogenität von Mykobakterieninfektionen bis hin zu einer möglichen Implikation als immunmodulatorische Mittel für die Behandlung von Infektionskrankheiten und anderen Pathologien wie Krebs. Hier wird ein einfacher Ansatz zur Extraktion und Analyse des Gesamtlipidgehalts und der Mykolsäurezusammensetzung von Mykobakterienzellen vorgestellt, die in einem festen Medium unter Verwendung von Mischungen organischer Lösungsmittel gezüchtet wurden. Sobald die Lipidextrakte erhalten sind, wird eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durchgeführt, um die extrahierten Verbindungen zu überwachen. Das Beispielexperiment wird mit vier verschiedenen Mykobakterien durchgeführt: dem schnell wachsenden Mycolicibacterium brumae und Mycolicibacterium fortuitum, dem abgeschwächten langsam wachsenden Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) und dem opportunistischen Erreger Mycobacterium abscessus, was zeigt, dass die im vorliegenden Protokoll gezeigten Methoden bei einer Vielzahl von Mykobakterien eingesetzt werden können.
Introduction
Mycobacterium ist eine Gattung, die pathogene und nicht-pathogene Arten umfasst, die sich durch eine hochhydrophobe und undurchlässige Zellwand auszeichnen, die durch ihre eigenartigen Lipide gebildet wird. Insbesondere enthält die mykobakterielle Zellwand Mykolsäuren, α-Alkyl- und β-Hydroxyfettsäuren sind, bei denen der α-Zweig in allen Mykolsäuren (mit Ausnahme der Länge) konstant ist und die β-Kette, die Meromykolatkette genannt, eine lange aliphatische Kette ist, die verschiedene funktionelle chemische Gruppen enthalten kann, die zusammen mit der Literatur beschrieben werden (α-, α’-, Methoxy-, κ-, Epoxid-, Carboxy- und ω-1-Methoxy-Mykolaten), die daher sieben Arten von Mykolsäuren (I-VII) produzieren1. Darüber hinaus sind auch andere Lipide von unbestreitbarer Bedeutung in der Zellwand von Mykobakterienarten vorhanden. Pathogene Arten wie Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose2 produzieren spezifische lipidbasierte Virulenzfaktoren wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIMs), phenolisches Glykolipid (PGL), Di-, Tri- und Penta-Acyltrehalose (DAT, TAT und PAT) oder Sulfolipide, unter anderem3. Ihre Anwesenheit auf der mykobakteriellen Oberfläche wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, die Immunantwort des Wirts und damit die Evolution und Persistenz des Mykobakteriums im Wirt zu modifizieren4. Zum Beispiel wurde das Vorhandensein von Triacylglycerinen (TAG) mit dem hypervirulenten Phänotyp der Lineage 2-Beijing-Unterlinie von M. tuberculosis, möglicherweise aufgrund seiner Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts abzuschwächen5,6. Andere relevante Lipide sind Lipooligosaccharide (LOS), die in tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien vorkommen. Im Falle von Mycobacterium marinumhängt das Vorhandensein von LOSs in seiner Zellwand mit der gleitenden Motilität und der Fähigkeit, Biofilme zu bilden, zusammen und stört die Erkennung durch Makrophagenmustererkennungsrezeptoren, was die Aufnahme und Ausscheidung der Bakterien durch Wirtspagoozyten beeinflusst7,8. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen oder Vorhandensein einiger Lipide die Klassifizierung von Mitgliedern derselben Spezies in verschiedene Morphotypen mit virulenten oder dämpfenden Profilen, wenn sie mit Wirtszellen interagieren. Zum Beispiel das Fehlen von Glykopeptidolipiden (GPL) im groben Morphotyp von Mycobacterium abscessus wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, eine intraphagosomale Übersäuerung und folglich Zellapoptose zu induzieren9, im Gegensatz zum glatten Morphotyp, der GPLs in seiner Oberfläche besitzt. Darüber hinaus hängt der Lipidgehalt der mykobakteriellen Zellwand mit der Fähigkeit zusammen, die Immunantwort im Wirt zu modifizieren. Dies ist relevant im Zusammenhang mit der Verwendung einiger Mykobakterien, um ein schützendes Immunprofil gegen verschiedene Pathologien auszulösen10,11,12,13. Es wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Mycolicibacterium vaccae, ein saprophytisches Mykobakterium, das sich derzeit in klinischen Phase-III-Studien als immuntherapeutischer Impfstoff gegen Tuberkulose befindet, weisen zwei koloniale Morphotypen auf. Während der glatte Phänotyp, der ein Polyester in seiner Oberfläche enthält, eine Th2-Reaktion auslöst, kann der raue Phänotyp ohne Polyester ein Th1-Profil induzieren, wenn er mit Immunzellen des Wirts interagiert.14. Das Repertoire der in der mykobakteriellen Zelle vorhandenen Lipide hängt nicht nur von mykobakterienarten ab, sondern auch von den Bedingungen der mykobakteriellen Kulturen: Zeitpunkt der Inkubation15,16 oder Zusammensetzung des Kulturmediums17,18. Tatsächlich beeinflussen Veränderungen in der Zusammensetzung des Kulturmediums die Antitumor- und immunstimulierende Aktivität von M. bovis BCG und Mycolicibacterium brumae in vitro17. Darüber hinaus wird das schützende Immunprofil ausgelöst durch M. bovis BCG gegen M. tuberculosis Die Herausforderung in Mäusemodellen hängt auch von den Nährmedien ab, in denen M. bovis BCG wächst17. Diese könnten dann mit der Lipidzusammensetzung der Mykobakterien in jedem Kulturzustand zusammenhängen. Aus all diesen Gründen ist die Untersuchung des Lipidgehalts von Mykobakterien relevant. Ein visuelles Verfahren zur Extraktion und Analyse der Lipidzusammensetzung der mykobakteriellen Zellwand wird vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein einfaches Protokoll, das als Goldstandardmethode für die Extraktion von nichtkovalent verknüpften Lipidverbindungen aus der mykobakteriellen Zellwand gilt, wird vorgestellt. Weitere Visualisierungen durch ein- und zweidimensionale TLCs aus den extrahierten Lipiden von vier verschiedenen Mykobakterien werden gezeigt.
Zwei aufeinander folgende kombinierte Mischungen von Chloroform und Methanol zur Wiederherstellung des Lipidgehalts von Mykobakterienzellen ist die am weitesten verbreitete L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (RTI2018-098777-B-I00), den FEDER Funds und der Generalitat of Catalunya (2017SGR-229) finanziert. Sandra Guallar-Garrido ist Trägerin eines PhD-Vertrags (FI) der Generalitat de Catalunya.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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