Анализ липидного состава микобактерий методом тонкослойной хроматографии
Summary
Представлен протокол извлечения общего содержания липидов в клеточной стенке широкого спектра микобактерий. Кроме того, показаны протоколы экстракции и анализа различных типов миколовых кислот. Также предусмотрен тонкослойный хроматографический протокол для мониторинга этих микобактериальных соединений.
Abstract
Виды микобактерий могут отличаться друг от друга скоростью роста, наличием пигментации, морфологией колонии, отображаемой на твердых средах, а также другими фенотипическими характеристиками. Тем не менее, все они имеют общий наиболее актуальный характер микобактерий: их уникальную и высокогидрофобную клеточную стенку. Виды микобактерий содержат мембранно-ковалентный связанный комплекс, который включает арабиногалактан, пептидобликан и длинноцепные миколовые кислоты с типами, которые различаются между видами микобактерий. Кроме того, микобактерии могут также продуцировать липиды, которые расположены, нековалентно связанные, на их клеточных поверхностях, такие как фтиоцерин димикоцерозаты (PDIM), фенольные гликолипиды (PGL), гликопептидолипиды (GPL), ацилтрегалозы (AT) или фосфатидил-инозитоловые маннозиды (PIM), среди прочих. Некоторые из них считаются факторами вирулентности патогенных микобактерий или критическими антигенными липидами во взаимодействии хозяин-микобактерия. По этим причинам существует значительный интерес к изучению микобактериальных липидов из-за их применения в нескольких областях, от понимания их роли в патогенности микобактерийных инфекций, до возможного подтекста в качестве иммуномодулирующих агентов для лечения инфекционных заболеваний и других патологий, таких как рак. Здесь представлен простой подход к извлечению и анализу общего содержания липидов и состава миколиновой кислоты клеток микобактерий, выращенных в твердой среде с использованием смесей органических растворителей. После получения липидных экстрактов проводится тонкослойная хроматография (TLC) для мониторинга экстрагированных соединений. Пример эксперимента проводится с четырьмя различными микобактериями: экологически быстрорастущей Mycolicibacterium brumae и Mycolicibacterium fortuitum, ослабленной медленно растущей Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) и оппортунистическим патогеном быстрорастущим Mycobacterium abscessus, демонстрируя, что методы, показанные в настоящем протоколе, могут быть использованы для широкого спектра микобактерий.
Introduction
Mycobacterium род, который включает патогенные и непатогенные виды, характеризующиеся высокогидрофобной и непроницаемой клеточной стенкой, образованной их специфическими липидами. В частности, клеточная стенка микобактерии содержит миколовые кислоты, которые являются α-алкильными и β-гидроксикислотами, в которых α-ветвь постоянна во всех миколовых кислотах (за исключением длины), а β-цепь, называемая меромиколатной цепью, представляет собой длинную алифатическую цепь, которая может содержать различные функциональные химические группы, описанные вместе с литературой (α-, α’-, метокси-, κ-, эпоксидные, карбокси- и ω-1-метокси-миколаты), поэтому продуцирует семь типов микольных кислот (I-VII)1. Более того, другие липиды, имеющие неоспоримое значение, также присутствуют в клеточной стенке видов микобактерий. Патогенные виды, такие как Mycobacterium tuberculosis, возбудитель туберкулеза2 продуцируют специфические факторы вирулентности на основе липидов, такие как фтиоцериновые димикоцерозаты (PDIMs), фенольные гликолипиды (PGL), ди-, три- и пента-ацилтрегалозы (DAT, TAT и PAT) или сульфолипиды, среди прочих3. Их присутствие на поверхности микобактерий было связано со способностью модифицировать иммунный ответ хозяина и, следовательно, эволюцией и персистенцией микобактерии внутри хозяина.4. Например, присутствие триацилглицерилов (TAG) было связано с гипервирулентным фенотипом lineage 2-Beijing sub-lineage of M. tuberculosis, возможно, из-за его способности обезсточивать иммунный ответ хозяина5,6. Другими соответствующими липидами являются липулигосахариды (LOS), присутствующие в туберкулезных и нетуберкулезных микобактериях. В случае Mycobacterium marinum, наличие LOSs в его клеточной стенке связано со скользящей подвижностью и способностью образовывать биопленки и препятствует распознаванию рецепторами распознавания образов макрофагов, влияя на поглощение и устранение бактерий фагоцитами хозяина7,8. Кроме того, отсутствие или присутствие некоторых липидов позволяет классифицировать представителей одного и того же вида на различные морфотипы с вирулентными или ослабленными профилями при взаимодействии с клетками-хозяевами. Например, отсутствие гликопептидолипидов (ГПЛ) в грубом морфотипе Mycobacterium abscessus был связан со способностью индуцировать внутрифагосомальное подкисление и, следовательно, клеточный апоптоз.9, в отличие от гладкого морфотипа, который обладает GPL в своей поверхности. Кроме того, содержание липидов в клеточной стенке микобактерии связано со способностью модифицировать иммунный ответ у хозяина. Это актуально в контексте использования некоторых микобактерий для запуска защитного иммунного профиля против различных патологий.10,11,12,13. Например, было продемонстрировано, что Mycolicibacterium vaccae, сапрофитная микобактерия, которая в настоящее время находится в фазе III клинических испытаний в качестве иммунотерапевтической вакцины против туберкулеза, демонстрирует два колониальных морфотипа. В то время как гладкий фенотип, который содержит полиэстер на своей поверхности, вызывает ответ Th2, грубый фенотип, лишенный полиэстера, может индуцировать профиль Th1, когда он взаимодействует с иммунными клетками хозяина.14. Репертуар липидов, присутствующих в микобактериальной клетке, зависит не только от видов микобактерий, но и от условий микобактериальных культур: время инкубации15,16 или состав питательной среды17,18. На самом деле изменения в составе культурального среды влияют на противоопухоляжную и иммуностимулаторную активность M. bovis БЦЖ и Mycolicibacterium brumae in vitro17. Кроме того, защитный иммунный профиль, вызванный M. bovis БЦЖ против M. tuberculosis Проблема в моделях мышей также зависит от культуры среды, в которой M. bovis БЦЖ растет17. Затем они могут быть связаны с липидным составом микобактерий в каждом состоянии культуры. По всем этим причинам актуально изучение содержания липидов микобактерий. Представлена визуальная процедура извлечения и анализа липидного состава клеточной стенки микобактерии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлен простой протокол, рассматриваемый в качестве золотого стандарта метода извлечения нековалентно связанных липидных соединений из клеточной стенки микобактерии. Показана дальнейшая визуализация одно- и двумерными ТЛК из извлеченных липидов четырех различных микобактери?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Министерством науки, инноваций и университетов Испании (RTI2018-098777-B-I00), фондами FEDER и Женералитатом Каталонии (2017SGR-229). Сандра Гуаллар-Гарридо является обладателем контракта phD (FI) от Женешитата Каталонии.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
