Yağdaki su damlacık tahlilleri analitik kimya, enzim evrimi ve tek hücre analizi için yararlıdır, ancak tipik olarak damlacıkları oluşturmak için mikroakışkanlar gerekir. Burada, damlacık tahlillerini gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz.
Monodispersed damlacıklarda gerçekleştirilen reaksiyonlar, toplu olarak gerçekleştirilen eşdeğerlere kıyasla daha yüksek doğruluk ve hassasiyet gösterir. Bununla birlikte, mikroakışkanların kontrollü damlacıklar oluşturma gereksinimi, uzman olmayanlara bir engel getirerek kullanımlarını sınırlar. Burada, mikroakışkanlar olmadan monodisperse damlacıkları üretmek için bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz. Templating hidrojel küreleri kullanarak, basit girdaplama ile monodispersed damlacıklarda örnekleri kapsülleriz. Mikroakışkan içermeyen dijital PCR gerçekleştirmek için kullanarak yaklaşımı gösteriyoruz.
Damlacık mikroakışkanları, toplu reaksiyonlara kıyasla testlerin hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için picoliter damlacıklarında bölümlere ayırmadan yararlanır ve kimyasal tarama, protein mühendisliği ve yeni nesil dizilemede çok sayıda uygulamaya sahiptir1,2,3. Örneğin, dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR), kanserlerde genetik varyasyon uygulamaları, mutasyonlara neden olan hastalığın tespiti ve doğum öncesi teşhis4,5,6 ile toplu nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile karşılaştırıldığında daha fazla doğruluk sunmaktadır. Bununla birlikte, damlacık mikroakışkanlarının bir zorluğu, mikroakışkan cihazların numuneleri bölümleme gereksinimidir; mikroakışkanlar damlacık özellikleri üzerinde mükemmel kontrol sağlarken, 7,8’i inşa etmek ve çalıştırmak için özel uzmanlık gerektirirler. Sonuç olarak, damlacık tabanlı yöntemler büyük ölçüde uzman laboratuvarlarla veya nadir durumlarda ticari bir cihazın mevcut olduğu uygulamalarla sınırlıdır9,10. Damlacık testlerinin kullanımını genişletmek için, özel mikroakışkan enstrümantasyon gereksinimi aşılması gereken bir engeldir.
Bu makalede, monodispersed damlacıklarda reaksiyonları gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yöntem olan Parçacık Şablonlu Emülsifikasyonu (PTE) açıklıyoruz. PTE’de, templating parçacıkları basit girdaplama ile numuneyi taşıyıcı yağdaki damlacıklara sarar (Şekil 1). Sistem karıştıkça, sulu kısım, damlacıklar tek parçacıklar içerene kadar küçültme boyutundaki damlacıklara dönüşür, bu noktada daha fazla parçalanma mümkün değildir, çünkü parçacıkların kırılmasını gerektirir. Yutulan örnek, parçacıkları damlacıklarda bir kabuk olarak çevreler, böylece dağınık hücreleri, reaktifleri veya fonksiyonel moieties’leri kapsüller (Şekil 1D). Bu nedenle, PTE ortak bir girdabın ötesinde damlacık reaksiyonları gerçekleştirmek için ekipman veya uzmanlık gerektirmez. Ayrıca, damlacık üretimi mikroakışkanlarla dakikalara veya saatlere kıyasla saniyeler alır ve üretilen miktar cihaz çalışma süresiyle değil, kapsayıcı hacmiyle orantılıdır ve bu da onu son derece ölçeklenebilir hale getirir. Bu faydalar PTE’yi, mikroakışkanların pratik olmayan çeşitli durumlarda damlacık tahlillerini yapmak için ideal hale getirir. Burada PTE’yi gösteriyoruz ve ddPCR’yi yürütmek için kullanıyoruz.
Şekil 1. Parçacık şablonlı emülsifikasyon işlemine genel bakış. (A) Templating parçacıkları reaktiflerle karıştırılır. (B) Santrifüjlemeden sonra fazla reaktifler çıkarılır. (C) Şablon moleküllerinin eklenmesi yağ ilavesinden önce gerçekleşir. (D) Girdap, tek şablon molekül içeren damlacıklar üretir. (E) Sonraki termosiklon ve görüntüleme, hedef şablonun dijital damlacık analizine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PTE, monodispersed damlacıklardaki örnekleri girdapla kaplayarak kapsüllemek için parçacıklar kullanır. PTE, basitliğine ve erişilebilirliğine ek olarak, büyük hacimlerde damlacıkların anında oluşturulmasına izin vermek de dahil olmak üzere çeşitli ek avantajlar sağlar. Ayrıca, süreç izole bir tüpte gerçekleştirilebilir, numunelerin mikroakışkan cihazlara aktarılması ihtiyacını ortadan ortadan, genel iş akışını kolaylaştırır ve numune kirlenmesi veya kaybı için fırsatları sınırlar. Templating parçacıkları ayrıca ortaya çıkan damlacık reaksiyonlarının içeriğini tasarlamak için bir araç sağlar. Örneğin, parçacık boyutu, kimya ve ıslanabilirlik hedeflenen biyomolekül veya hücre yakalama için tasarlanmış olabilirken, enzimler, aktifler veya nükleik asitler gibi fonksiyonel moieties, tek hücre dizilimi veya fonksiyonel karakterizasyon gibi reaksiyonları kolaylaştırmak için parçacık üzerinde görüntülenebilir. Yaklaşım esnek olsa da, kullanımı için önemli kısıtlamalar vardır. Örneğin, şu anda, tüm reaksiyon bileşenlerinin kapsüllemeden önce tanıtılmasını gerektiren mikroakışkanlarla sıklıkla yapıldığı gibi damlacık eklemeleri yapmak mümkün değildir; bu, damlacıklar üretilene kadar reaktiflerin uyumlu ve kararlı olmasını gerektirir ve zahmetli kombinasyonlar durumunda, numunenin buz üzerinde hızlı bir şekilde karıştırılması ve emülsiyonu ile ele alınabilir. Alternatif olarak, ışık veya ısı ile harici olarak tetiklenebilen reaktif bileşenler kullanılabilir13. PTE böylece uzman olmayanların erişebileceği damlacık tahlillerini yürütmek için esnek ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu, doğuştan gelen basitliği ve esnekliği ile birleştiğinde, PTE’yi çok sayıda damlacık uygulamasının yürütülmesi ve geliştirilmesi için ideal hale getirir.
The authors have nothing to disclose.
Bu protokolü geliştiren bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-EB019453-02), Ulusal İstihbarat Direktörlüğü tarafından desteklenmiştir. Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507) aracılığıyla İstihbarat İleri Araştırma Projeleri Faaliyeti, Chan-Zuckerberg Biohub Araştırmacı Programı, Texas A&M Üniversitesi (W911NF1920013) aracılığıyla Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı ve Johns Hopkins Üniversitesi Aracılığıyla Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri Başvurdu Fizik Laboratuvarı (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Burada yer alan görüşler ve sonuçlar yazarların görüşleridir ve yukarıdaki kuruluşların veya ABD Hükümetinin ifade edilen veya ima edilen resmi politikalarını temsil ettiği şeklinde yorumlanmamalıdır. ABD Hükümeti, herhangi bir telif hakkı ek açıklamasına bakılmaksızın, resmi amaçlarla yeniden baskıları çoğaltmaya ve dağıtmaya yetkilidir.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |