Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Daniel W. Weisgerber; Makiko N. Hatori; Adam R. Abate

doi:10.3791/62248

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biology

Эмульгирование с шаблоном частиц позволяет проводить микрофлюидные капельные анализы

Published: March 09, 2021

doi:

10.3791/62248

Daniel W. Weisgerber¹, Makiko N. Hatori¹, Adam R. Abate^1,2

¹Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences,University of California, ²Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Капельные анализы «вода в масле» полезны для аналитической химии, эволюции ферментов и анализа одиночных клеток, но обычно требуют микрофлюидики для образования капель. Здесь мы описываем шаблонную эмульгацию частиц, безфлюидный подход к выполнению капельных анализов.

Abstract

Реакции, выполняемые в монодисперсных каплях, обеспечивают повышенную точность и чувствительность по сравнению с аналогичными реакциями, выполняемыми оптом. Однако требование микрофлюидики к образованию контролируемых капель накладывает барьер для неспециалистов, ограничивая их использование. Здесь мы описываем шаблонную эмульгацию частиц, подход к генерации монодисперсных капель без микрофлюидики. Используя шаблонные гидрогелевые сферы, мы инкапсулируем образцы в монодисперсные капли простым вихрем. Мы демонстрируем этот подход, используя его для выполнения цифровой ПЦР без микрофлюидности.

Introduction

Микрофлюидика капель использует компартментализацию в пиколитрных каплях для повышения чувствительности и точности анализов по сравнению с объемными реакциями и имеет многочисленные применения в химическом скрининге, белковой инженерии и секвенировании следующего ^{поколения1,2,3}. Например, цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (ddPCR) обеспечивает повышенную точность по сравнению с объемной количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), с приложениями для генетических вариаций при раке, обнаружения мутаций, вызывающих заболевание, и пренатальной диагностики4,5,6. Однако одной из проблем, связанных с микрофлюидикой капель, является требование к микрофлюидным устройствам разделять образцы; в то время как микрофлюидика обеспечивает превосходный контроль над свойствами капель, они требуют специализированных знаний для создания и ^{эксплуатации7,8}. Следовательно, методы на основе капель в значительной степени ограничены экспертными лабораториями или, в редких случаях, приложениями, в которых доступен коммерческий ^{инструмент9,10}. Для расширения использования капельных анализов потребность в специализированных микрофлюидных приборах является препятствием, которое необходимо преодолеть.

В этой статье мы опишем эмульгирование частиц (PTE), метод без микрофлюидности для выполнения реакций в монодисперсных каплях. В PTE частицы шаблона поглощают образец в капли в масле-носителе простым вихрем (рисунок 1). По мере смешивания системы водная часть распадается на капли уменьшающегося размера, пока капли не содержат одиночные частицы, и в этот момент дальнейшая фрагментация невозможна, поскольку это требует разрушения частиц. Поглощенный образец окружает частицы как оболочку в каплях, тем самым инкапсулируя любые дисперсные клетки, реагенты или функциональные фрагменты (рисунок 1D). Таким образом, PTE не требует никакого оборудования или опыта для выполнения капельных реакций за пределами общего вихря. Кроме того, генерация капель занимает секунды по сравнению с минутами или часами с микрофлюидикой, а производимое количество пропорционально объему контейнера, а не времени работы устройства, что делает его в высшей степени масштабируемым. Эти преимущества делают PTE идеальным для проведения капельных анализов в различных обстоятельствах, в которых микрофлюидика непрактична. Здесь мы демонстрируем PTE и используем его для проведения ddPCR.

Рисунок 1. Обзор процесса эмульгирования по шаблонам частиц. (А) Частицы шаблона смешиваются с реагентами. (B) Избыточные реагенты удаляются после центрифугирования. (C) Добавление шаблонных молекул происходит до добавления масла. (D) Вихрь производит капли, содержащие одну молекулу шаблона. (E) Последующая термоциклировка и визуализация позволяют проводить цифровой капельный анализ целевого шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

1. Подготовка частиц гидрогеля для шаблонной эмульгирования частиц. Частицы гидрогеля, используемые для эмульгирования частиц по шаблонам, могут быть получены с использованием двух различных методов. Препарат с использованием коммерчески доступных частиц Добавьте 0,5 г высушенных полиакриламидных частиц, совместимых с PTE (например, Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), диаметром 45-90 мкм), к 30 мл стерильной воды в конической трубке объемом 50 мл и хорошо перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Препарат с использованием микрофлюидного изготовления частицПРИМЕЧАНИЕ: Полиакриламидные частицы, совместимые с PTE, могут быть получены с использованием коммерчески доступных капель (например, генератора капель QX200 (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) и т. Д.), Или с помощью пользовательской микрофлюидной конструкции.Изготовление кастомного мастера Разработайте мягкую фотолитографическую маску с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (CAD). Распечатайте фотомаску с разрешением 10 мкм на пленке печатной платы. Налейте 1 мл фоторезиста на центр 3 кремниевой пластины. Используйте спин-коатер для создания слоя фоторезиста 50 мкм, вращая его со скоростью 500 об/мин в течение 30 секунд, а затем 1250 об/мин в течение 30 секунд. Поместите пластину на конфорку, установленную на 95 °C, в течение 15 минут, чтобы испарить растворитель. Закрепите фотомаску на кремниевой пластине с помощью стеклянного затвора и обнажите пластину под коллимированным УФ-светодиодом мощностью 190 мВт, 365 мкм в течение 2,5 мин. Поместите на конфорку, установленную при температуре 95 °C, на 5 минут для выпечки после экспозиции. Разработайте фоторезистно-кремниевую пластину, погружая ее в ванну со 100% пропиленгликолем монометилового эфира ацетата (PGMEA) на срок до 15 мин. Смойте пластину свежим 100% PGMEA, а затем 100% изопропанолом. Высушите пластину на воздухе. Удалите остатки изопропанола, высушив пластину на конфорке, установленной на 95 °C в течение 1 мин. Поместите в чистую 3 в чашку Петри. Изготовление пользовательского микрофлюидного устройства Смешайте кремниевую основу полидиметилсилоксана (PDMS) и реагент для отверждения в соотношении 10:1 по массе. Дегазируйте смешанную PDMS с помощью адсорбатора под домашним вакуумом до тех пор, пока не будут наблюдаться пузырьки воздуха. Вылейте дегазированную PDMS на мастер в чашку Петри, убедившись, что кремниевая пластина полностью погружена. Дегазируйте кремниевую пластину и PDMS, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые могли образоваться во время заливки. Вылечите PDMS, поместив кремниевую пластину и PDMS в духовку, установленную на 65 °C в течение не менее 60 минут. Вырежьте блок PDMS, содержащий микрофлюидные признаки, из чашки Петри с помощью скальпеля. Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить какие-либо функции, присутствующие на кремниевом мастере. Продувите входные и выходные отверстия в блок PDMS, соответствующий входам и выходам в микрофлюидном устройстве, используя 0,75 мм биопсийный перфоратор. Удалите пыль и твердые частицы с помощью повторяющегося нанесения и удаления упаковочной ленты на поверхность блока PDMS. Очистите стеклянный предмет 50 мм x 75 мм, промыв его 100% изопропанолом и затем высушив поверхность на воздухе. Плазменная обработка как стеклянного слайда, так и PDMS (особенности обращены вверх) с использованием 1 мбар плазмы O2 в течение 1 мин с использованием плазменного бондера. Прикрепите PDMS к стеклянному слайду, поместив обработанную плазмой PDMS с элементами, обращенными вниз, на стеклянный слайд, обработанный плазмой стороной вверх. Поместите зажим в духовку, установленную при температуре 65 °C, по крайней мере, на 30 минут, чтобы завершить склеивание. Обработайте все микрофлюидные каналы фторированной обработкой поверхности, чтобы обеспечить гидрофобность поверхности и предотвратить смачивание. Выпекайте прибор при 65 °C в течение не менее 10 мин. Изготовление шаблонизирующих частиц Готовят раствор полиакриламида (ПАА), состоящий из 6,2% акриламида, 0,18% N,N’-метиленебиса (акриламида) и 0,3% персульфата аммония. Загрузите этот раствор в шприц объемом 1 мл с помощью иглы 28G. Готовят нерастворимую непрерывную фазу, состоящую из 5% (мас./мас.) фторповерхностно-растительного вещества и 1% N,N,NN-тетраметилэтилендиамина (TEMED) в гидрофторэфирующем (HFE) масле для образования и стабилизации капель. Загрузите раствор в новый шприц объемом 1 мл. Загрузите раствор PAA и HFE, содержащий шприцы, в шприцевые насосы (например, NE-501). Подключите оба шприца к микрофлюидному устройству с помощью полиэтиленовой трубки, вставленной в шприц и в устройство. Перед подключением загрунтуйте насосы, чтобы удалить воздух из трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от модели, шприцевыми насосами можно управлять с помощью встроенного ввода, программного обеспечения для производства или пользовательского сценария (доступен в https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). Запустите устройство генерации капель с входами масла PAA и HFE со скоростью 300 мкл/ч и 500 мкл/ч соответственно. Собрать 1 мл капель в 15 мл и инкубировать в течение 3 ч при комнатной температуре для полимеризации. После инкубации удалите нижний слой масла путем пипетки. Добавьте 1 мл 20% (v/v) перфтор-1-октанола (PFO) в HFE масле в 15 мл в качестве химического деэмульгатора. После перемешивания открутите трубку для сбора 15 мл при 2000 х г в течение 2 мин. Удалите супернатант PFO/HFE путем пипетки. Повторите 1x. Добавьте 2 мл 2% моноолеата сорбитана в гексане в 15 мл и вихре для смешивания. Раскрутите тюбик при 3000 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант путем пипетки для удаления раствора поверхностно-активного вещества/гексана. Повторите 2x. Добавьте 5 мл буфера TEBST (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 274 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 20 мМ ЭДТА, 0,2% Triton X-100) и хорошо перемешайте. Открутите при 3 000 x g в течение 3 мин. Удалите супернатант путем пипетирования. Повторите 3x. Повторное суспендирование в 5 мл TEBST. Этот раствор может храниться при температуре 4 °C неопределенно долго. 2. Эмульгирование частиц. После приготовления шаблонных частиц PTE используется для инкапсулирования образца и реагентов в капли. Подготовьте частицы полиакриламида для эмульгирования частиц путем центрифугирования при 6000 х г в течение 1 мин для гранулирования частиц, затем удалите супернатант путем пипетирования и повторного суспендирования с использованием стерильной воды. Повторите 3x, чтобы обеспечить удаление любого остаточного TEBST. Определите концентрацию и диаметр шаблонизирующих частиц с помощью гемоцитометра (или эквивалента). Рассчитайте диаметр отдельных частиц, измерив диаметры в пикселях и преобразовав их в микроны. Преобразование пикселей в микроны может быть рассчитано с использованием гемоцитометра (или эквивалента) в качестве калибровочного слайда и измерения известного расстояния сетки в пикселях. Подготовьте дисперсную фазу в свежей микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл с использованием мастер-смеси ПЦР, соответствующих праймеров и гидролизного зонда флуоресцеина в соответствии с таблицей 1. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин при мягком перемешивании (10 об/мин) с помощью трубчатого ротатора для обеспечения однородного распределения компонентов.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем и целевая концентрация частиц основаны на нагрузке Пуассона. Как правило, число частиц должно быть на порядок больше, чем число инкапсулируемых образцов. Для образцов неизвестных концентраций для обеспечения загрузки Пуассона необходим ряд разрежения. Том Реагент 100 мкл Частицы (450 частиц / мкл) 200 мкл 2x ПЦР мастер микс 18 мкл 10 мкМ прямая грунтовка 18 мкл Обратная грунтовка 10 мкМ 18 мкл Зонд 10 мкМ 0.8 мкл Тритон X100 45.2 мкл Вода без нуклеаз Таблица 1. Приготовление мастер-микса ПЦР, используемого с ПТЭ для цифровой капельной ПЦР. Центрифугируют дисперсную фазу при 6000 х г в течение 1 мин и удаляют супернатант. Запишите объем извлеченного супернатанта и с помощью общего объема дисперсной фазы, рассчитанного в 2,3 , определите объем окатышей.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество экстрагируемого супернатанта будет варьироваться в зависимости от упаковки, диаметра и концентрации частиц с минимальным ожидаемым объемом 300 мкл. Добавьте 1 мкл 1,62 пг/мкл геномной ДНК Saccharomyces cerevisiae к грануле из 2,4 и тщательно перемешайте путем пипетирования или энергичного постукивания.ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие избыточного водного содержимого может снизить эффективность инкапсуляции. Если объем образца превышает 1% от объема гранул, сконцентрируйте образец. Если образец не может быть сконцентрирован, масштабируйте мастер-смесь ПЦР и полученный объем гранул в соответствии с объемом образца. PTE позволяет эмульгировать малые (10 мкл) и большие (2 мл) объемы шаблонизирующих частиц. Мастер-смесь ПЦР (2,3) и масло (2,6) могут быть масштабированы в соответствии с целевым (2,3) и измеренным (2,4) объемом гранулы частиц соответственно. Добавьте 200 мкл 2% фторповерхностного вещества в HFE масло в трубку в качестве нерастворимой непрерывной фазы для эмульгирования. Убедитесь, что гранула смещена путем пипетки или постукивания/щелчка трубки. Затем вихрь при 3000 об/мин в течение 30 сек.ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка, соответствующая 3000 об/мин, может варьироваться в зависимости от марки и модели. Дайте эмульсиям отстояться в течение 1 мин. Удалите 100 мкл нижней масляной фазы и замените этот объем свежим 2% фторповерхностным веществом в HFE масле. Осторожно переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать. Повторяйте 3-5 раз или до тех пор, пока не будут удалены небольшие спутниковые капли. 3. Цифровая капельная ПЦР и анализ. После 2-5 мин отстаивания удалите нижнюю масляную фазу. Замените этот объем 5% фторповерхностным веществом во фторуглеродном масле (например, FC-40). Используя широкий наконечник пипетки, аккуратно переложите 100 мкл образца в 200 мкл ПЦР-пробирки. Поместите трубки ПЦР в термоциклер и работайте в соответствии с таблицей 2. Шаг Температура Длительность Примечания 1 95 °С 2 мин 2 95 °С 30 с 3 50 °С 90 с 4 72 °С 60 с 5 Повторите шаги x34 со 2 по 4 6 72 °С 2 мин 7 4 °С держать Таблица 2. Условия термоциклирования для цифровой капельной ПЦР с использованием эмульсий PTE. Пипетка образца на счетный слайд с помощью широкого наконечника пипетки для флуоресцентной визуализации. Визуализируйте образец с помощью флуоресцентного микроскопа с волнами возбуждения 490 нм и обнаружением излучения 525 нм. Количественно оцените положительные флуоресцентные капли (Np) и общее количество капель (NT) для проверки присутствия и расчета количества шаблонных молекул (λ), используя долю положительных капель (Np / NT) и статистику Пуассона: Рассчитайте 95% доверительный интервал (zc = 1,96) следующим образом: Рассчитайте концентрацию образца (молекулы/мкл), используя объем (ν в мкл) образца, добавленного на шаге 2.5, используя уравнение, приведенное ниже. Определите среднее и стандартное отклонение концентрации образца с помощью технических реплик.

Representative Results

Рисунок 2. Инкапсуляция образца в капли с использованием шаблонной эмульгирования частиц. (A) шаблонизация частиц, используемых для эмульгирования частиц. (B) Отделение гранул частиц шаблона от супернатанта после центрифугирования. (C) Капли, образующиеся в результате эмульгирования по образцу частиц с (D) идентифицируемой водной оболочкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. В PTE монодисперсность эмульсий диктуется монодисперсностью частиц шаблона, потому что капли имеют диаметр немного больше, чем частицы. Таким образом, однородные частицы занимают центральное место в контролируемой инкапсуляции PTE11. Существует множество методов генерации однородных шаблонизирующих частиц, включая химические (золь-гель, эмульсионная полимеризация), гидродинамические (мембранная эмульгация, гомогенизация) и методы фильтрации. Микрофлюидные подходы, в частности, обеспечивают превосходную монодисперсность (рисунок 2A) и позволяют дополнительной инженерии частиц для повышения их функциональности в PTE12. В качестве альтернативы можно приобрести частицы-шаблоны, хотя их однородность, хотя и адекватна, обычно меньше, чем при микрофлюидной генерации11. Для выполнения PTE частицы смешивают с образцом, подлежащим инкапсулированию (рисунок 1A), а избыток супернатанта удаляют центрифугированием и пипетированием (рисунок 1B), как показано фотографией гранулы частицы на дне трубки ПЦР (рисунок 2B). Затем добавляют инкапсулирующее масло, содержащее стабилизирующее поверхностно-активное вещество (рисунок 1C), и образец осторожно пипетируют перед вихрем в течение 30 секунд (рисунок 1D), чтобы получить эмульсию (рисунок 2C). Полученные капли содержат ядро частицы и водную оболочку, содержащую исходный образец, внутри которого находятся реагенты, молекулы-мишени и клетки, необходимые для реакции (рисунок 2D). Так же, как и в микрофлюидной инкапсуляции капель, дискретные сущности, такие как маленькие шарики или клетки, инкапсулируются случайным образом и в соответствии с распределением Пуассона, хотя почти все капли содержат частицу-шаблонистку из-за природы физики PTE. Рисунок 3. Идентификация и очистка капель эмульгирования по шаблонам частиц. (A) Пример неоднородного образования капель с множественными частицами на каплю от недостаточного вихря. B) ожидаемое присутствие спутников и капель после эмульгирования по образцу частиц и С) фракционирования воды в масле. (D) Полученная эмульсия после промывки масла. Е) чрезмерная спутниковая генерация в результате остаточного супернатанта в ходе эмульгирования по образцам частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Даже при успешном ПТЭ существуют капли с двойным или тройным ядром, хотя они, как правило, незначительно влияют на реакцию, при условии, что они редки. Достижение низкой частоты многоядерных капель при сохранении адекватных оболочек требует оптимизации параметров процесса, включая поверхностное натяжение, силы адгезии между частицами, вязкость образца, размер контейнера, а также мощность и время вихря. Например, плохо оптимизированное эмульгирование может содержать полидисперсные капли со многими шаблонизирующими частицами (фиг.3А), что указывает на то, что вихрь был недостаточным для полной эмульгации образца. В таких случаях моющие средства могут быть добавлены для уменьшения адгезии между частицами и снижения поверхностного натяжения, или может быть увеличена вихревая мощность или время. Другой распространенной проблемой является генерация избыточных спутников, которые представляют собой небольшие пустые капли (рисунок 3B). Спутники могут быть неизбежны в эмульсиях PTE в зависимости от межфазного напряжения и реологических свойств образца и масла-носителя. Однако они часто возникают в результате недостаточного удаления избыточного образца перед эмульгированием (рисунок 2B) или вихря со слишком большой мощностью, удаляя оболочки из капель. При успешном эмульгировании PTE спутники должны составлять не более ~10% от общего объема инкапсулированного образца (рисунок 3C)11. На этом уровне они обычно вносят незначительный вклад в реакцию и могут быть проигнорированы. В эстетических целях их можно очистить от эмульсии путем промывки свежим маслом (рисунок 3D). Рисунок 4. Оценка цифровой капельной ПЦР эмульгирования частицами. (A) Флуоресцентная визуализация капель идентифицирует положительные флуоресцентные капли и отрицательные нефлуоресцентные капли. (B) Идентификация редкого шаблона или низких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. (C) Чрезмерная инкапсуляция шаблона, приводящая к переменному количеству молекул шаблона на каплю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Чтобы продемонстрировать полезность PTE, мы использовали его для выполнения цифровой PCR11 без микрофлюидности. Используя этот процесс, мы инкапсулировали образец, содержащий геномную ДНК S. cerevisiae , и термоциклировали его. При цифровой ПЦР капли, содержащие амплифицированные мишени, становятся флуоресцентными, в то время как без них остаются тусклыми. Таким образом, флуоресцентная капля указывает цель, позволяя напрямую количественно оценивать цели путем подсчета положительных капель (рисунок 4A). Таким образом, количество флуоресцентных капель масштабируется вместе с молекулами-мишенями, давая мало положительных результатов, когда мишень редка (рисунок 4B) и много, когда она в изобилии (рисунок 4C). Как и в случае с инкапсуляцией других дискретных компонентов, целевая инкапсуляция следует распределению Пуассона, позволяя положительной фракции капель трансформироваться в целевую концентрацию (рисунок 4D), тем самым демонстрируя способность выполнять цифровую ПЦР с PTE11. Рисунок 5. Демонстрация цифровой капельной ПЦР с использованием коммерчески доступной ПАА. (A) Флуоресцентная визуализация капель идентифицирует отрицательные нефлуоресцентные капли. (B) Идентификация низких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. (C) Идентификация высоких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Эти результаты повторяются с использованием коммерчески доступных полиакриламидных частиц (рисунок 5) и демонстрируют способность PTE выполнять стандартную цифровую ПЦР с коммерчески доступными полиакриламидными частицами, достигая точных измерений в том же диапазоне. Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

PTE использует частицы для инкапсуляции образцов в монодисперсные капли путем вихря. В дополнение к своей простоте и доступности, PTE обеспечивает несколько дополнительных преимуществ, в том числе позволяет мгновенно генерировать большие объемы капель. Кроме того, процесс может проводиться в изолированной пробирке, устраняя необходимость передачи образцов в микрофлюидные устройства, оптимизируя общий рабочий процесс и ограничивая возможности для загрязнения или потери образцов. Частицы шаблона также обеспечивают средство, с помощью которого можно спроектировать содержание результирующих капельных реакций. Например, размер частиц, химический состав и смачиваемость могут быть спроектированы для целенаправленного захвата биомолекул или клеток, в то время как функциональные фрагменты, такие как ферменты, активные вещества или нуклеиновые кислоты, могут отображаться на частицах для облегчения реакций, таких как секвенирование отдельных клеток или функциональная характеристика. Хотя этот подход является гибким, тем не менее существуют серьезные ограничения на его использование. Например, в настоящее время невозможно выполнять капельные добавления, как это часто проводится с микрофлюидикой, требуя, чтобы все компоненты реакции были введены перед инкапсуляцией; это требует, чтобы реагенты были совместимыми и стабильными до тех пор, пока не будут образовываться капли, а в случае неприятных комбинаций часто могут быть устранены путем быстрого смешивания и эмульгирования образца на льду. Альтернативно, могут быть использованы реакционноспособные компоненты, которые могут быть вызваны внешним воздействием света или ^тепла13. Таким образом, PTE обеспечивает гибкий и масштабируемый метод проведения капельных анализов, доступный для неспециалистов. Это, в сочетании с присущей ему простотой и гибкостью, делает PTE идеальным для выполнения и разработки многочисленных капельных приложений.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа по разработке этого протокола была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01-EB019453-02), Управлением директора Национальной разведки, деятельностью по перспективным исследовательским проектам разведки через Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Программой исследователей биохабов Чан-Цукерберга, Агентством перспективных исследовательских проектов министерства обороны через Техасский университет A & M (W911NF1920013) и Центрами по контролю и профилактике заболеваний через Университет Джона Хопкинса Applied Лаборатория физики (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Мнения и выводы, содержащиеся в настоящем документе, являются мнениями и выводами авторов и не должны толковаться как обязательно представляющие официальную политику, выраженную или подразумеваемую, вышеуказанных организаций или правительства США. Правительство США уполномочено воспроизводить и распространять перепечатки для правительственных целей, несмотря на любые аннотации, содержащиеся в авторских правах.

Materials

0.22 um syringe filter	Milipore Sigma	SLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo-Fisher	15575020
0.75 mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
1 mL syringes	BD	309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)	Sigma-Aldrich	370533
1M Tris-HCI, pH 8.0	Thermo-Fisher	15568025
27 gauge needles	BD	305109
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
3D-printed centrifuge syringe holder	(custom)	(custom)
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A4058-100ML
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Aquapel (fluorinated surface treatment)	Pittsburgh Glass Works	47100
Hexane	Sigma-Aldrich	139386
FC-40 fluorinated oil	Sigma-Aldrich	F9755
Isopropanol	Sigma-Aldrich	109827
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)	3M	98-0212-2928-5
polyethylene tubing	Scientific Commodities	B31695-PE/2
fluorosurfactant	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant
PGMEA developer	Sigma-Aldrich	484431
Photomasks	CadArt Servcies	(custom)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Spin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Span 80 (sorbitane monooleate)	Sigma-Aldrich	s6760
SU-8 3025 photoresist	Kayaku	17030192
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	t8787
Tween 20 (polysorbate 20)	Sigma-Aldrich	p2287
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Yeast FWD	IDT	5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′
Yeast REV	IDT	5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3
Yeast Probe	IDT	5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′
EVOS FL AUTO	Life Technologies
EVOS LED Cube, GFP	Life Technologies	AMEP4651
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)	Dow Corning	DC4019862
TEMED	Thermo Fisher	17919
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA	Milipore	69240-3
Expanded plasma cleaner (plasma bonder)	Harrick Plasma	PDC-002 (230V)

References

Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).
Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging Droplet Microfluidics. Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).
The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Weisgerber, D. W., Hatori, M. N., Abate, A. R. Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays. J. Vis. Exp. (169), e62248, doi:10.3791/62248 (2021).

Automatically Generated